菌種

【注音】jūnzhǒng

【釋義】是指食用菌、工業菌、農用菌菌絲體及其生長基質組成的繁殖材料。菌種是從事微生物學及生命科學研究的基本材料，在醫學領域中，診斷製品的製備，菌苗的生產、微生物致病性研究，藥物的抑菌試驗及藥品微生物檢驗等都有一套完整的菌種菌種分為母種（一級種）、原種（二級種）和栽培種（三級種）三級。

2006年3月中華人民共和國農業部發布的《食用菌菌種管理辦法》規定：“農業部主管全國菌種工作。縣級以上地方人民政府農業（食用菌，下同）行政主管部門負責本行政區域內的菌種管理工作。”“縣級以上地方人民政府農業行政主管部門應當加強食用菌種質資源保護和良種選育、生產、更新、推廣工作，鼓勵選育、生產、經營相結合。”

工業發酵的有用菌種，其篩選步驟包括菌種分離、初篩和復篩，挑選具有某種能力的有用菌種。

首先是從土壤或腐生植物中收集含菌樣品，用無菌水稀釋后，塗佈於置有適宜細菌、放線菌或黴菌生長的瓊脂培養基平皿上，並將其倒置於恆溫箱中，培養一定時間，平皿上長出的許多單個菌落（單一微生物的集落）經分別分離后即為各種純種菌株，簡稱純種，移種至試管斜面培養基上，置4℃冰箱備用。

根據不同的篩選目的，採用不同的篩選模型。如常規篩選抗生素產生菌的方法是將土壤中分離所得的純種，在含有瓊脂培養基的平皿上培養后，用打孔器將菌塊移至含有試驗菌的瓊脂培養基上，在適宜的溫度下培養一定時間后取出，如在菌塊的周圍有透明的抑菌圈，則表明此菌種具有產生抑制試驗菌生長的抗菌物質的能力。所得菌種經過搖瓶液體發酵，測定發酵液或菌絲體內抗生素的含量，選出生產能力高的菌種。另一方面對所提取的抗生素進行結構分析、藥理試驗及臨床試驗等，確為有效者，即可作為生產菌種。又如篩選脂肪酶生產菌種的方法是將分離所得的黴菌塗佈於含有牛脂的瓊脂培養基上，恆溫培養一定時間，如菌落周圍出現透明圈的，則該菌具有分解脂肪的能力，進一步作搖瓶發酵測定酶活力，挑選產量高者作生產菌種的出發菌株。

即採用遺傳育種的方法，使野生型菌株(從自然界分離篩選而得的出發菌株)的遺傳因子 DNA發生突變、重組，從而從中選出產量高、成品質量好或具有新的培養特性如耐產物抑制、能利用廉價原料以及具有生產新品種能力的優良菌種。採用的方法有誘變育種、雜交育種、細胞融合技術和重組DNA技術。誘變育種是利用誘變因子如紫外線、鈷－60、乙烯亞胺類等物理或化學誘變劑處理生產菌株的單孢子懸浮液，以獲得誘發突變株。隨後進行突變株的篩選，從中篩選高產菌株。由於隨機的突變群體中，有益突變所佔比例很低，要獲得高產突變株必須進行大量篩選。可根據生物合成途徑中的反應點，並通過它們的改變以提高產率或其他特性，如選育抗產物反饋抑制的突變株、增加細胞透性的突變株及營養缺陷型的突變株等。這種“理性篩選法”廣泛應用於氨基酸產生菌的選育。

也稱種子製備，是指菌種在一定條件下，經過擴大培養成為具有一定數量和質量的純生產菌種的製備過程。以作接入發酵罐中進一步擴大菌體量及合成產物之用。種子製備包括孢子製備和菌絲體製備（見圖） ，其中(1)～(4)為孢子製備過程。保存在沙土管或冷凍管中的生產菌種，用無菌手續挑取少許，接入瓊脂斜面培養基上，在25℃（或較高溫度）下培養5～7天(或較長時間)。所得孢子還需進一步用較大表面積的固體培養基以獲得更多孢子，對於黴菌類孢子製備，多數採用大米、小米之類的天然培養基。將培養成熟的斜面孢子製成懸浮液，接種到扁瓶固體培養基上，於25～28℃培養14天。將成熟的扁瓶孢子於真空中抽干，使水分降至10%以下，並放入 4℃冰箱中備用。一次製得的孢子瓶可在生產上延續使用半年左右。放線菌孢子的培養基大多是採用麩皮或豌豆浸出液、牛肉膏及無機鹽與瓊脂製成的。將斜面孢子接入擴大的扁瓶孢子培養基中，於28～37℃培養5～14天。所獲得的大量孢子可直接作為種子罐 (6)的種子。如果有些生產菌種不產孢子，如赤霉素產生菌或產孢子不多的，則可採用搖瓶（5）液體培養製得菌絲體，作種子罐的種子。種子罐的目的是使接入有限的孢子或菌絲體迅速發芽、生長、繁殖成大量菌體。其中的培養基組分應是易於被菌體利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米漿等）,及無機鹽(如磷酸鹽)等。作為發酵罐(7)的種子應是生命力旺盛、染色深、菌絲粗壯，無雜菌及異常菌體。接種量一般在10%～20%。

使優良菌種的性狀保持穩定，人為地創造條件，使菌種的新陳代謝活動處於不活潑狀態，即選取優良菌種的休眠體（孢子或芽孢）或富有生命力的懸浮液在低溫或脫水狀態下保存。

①簡單保存法，將瓊脂斜面孢子培養物、菌絲懸浮液以及由麩皮、大米、小米等穀物原料製成的孢子培養物置於4℃冰箱保存，保存時間不超過1～2個月，若將穀物原料製備的孢子瓶抽真空並在棉塞上浸蠟，以隔絕外界空氣和水汽，保持時間可達3～4個月；②液氮超低溫保存法，將生長穩定期的細胞懸浮在10%甘油或其他低冰點液體中，密封於安瓿管內，然後控制冷卻速度，使安瓿管溫度逐步下降至 -35℃時，即可置於-150～-196℃的液氮罐中保存。大多數微生物如病毒、噬菌體、多種細菌、放線菌、酵母和原蟲、特別是一些用冷凍乾燥法有困難的微生物，都可用此法長期保存。

①沙土保存法，能產孢子的細菌、放線菌及黴菌可採用此法保存，即將沙和土以3:2比例混合，經稀酸處理洗凈過篩，裝入小試管內，裝置高度為1cm;滅菌2～3次，烘乾后即可將在斜面培養基上生長良好的孢子，用無菌蒸餾水2～2.5ml製成孢子懸液，吸取少許加入沙土管中，經真空抽干，外觀呈鬆散狀態，於4℃冰箱保存，保存期可達5～7年。

② 冷凍乾燥法，將孢子懸浮液與保護劑（一般用脫脂牛奶或血清）相混合，放在安瓿管內於-20～-30℃的乙醇浴中速凍。然後，在低溫下用真空泵抽干，並用五氧化二磷或乾冰使水汽結凍，熔封安瓿管，於低溫下保存。保存期可達5～10年之久。

③ 石蠟油封存法，在斜面菌種培養物上，倒上滅菌后的石蠟油，高出斜面1cm，於4℃冰箱或低溫乾燥處保存，此法不適用於能利用石蠟油作碳源的微生物，保存期為一年以上。

一，菌種的概念 原意是指孢子(相當於植物的種子) ,但在實際生產中，常將經過人工培養的純菌絲體連同培養基質一同叫做菌種.

二，菌種的類型 在生產中根據菌種的來源，繁殖代數及生產目的，把菌種分為母種，原種和栽培種。分別叫一級種，二級種，三級種.

母種：將純菌絲體或孢子在試管培養基中繁殖而成。可以繁殖原種，也適宜菌種保藏.

原種：母種菌絲在固體培養基上繁殖而成。這一過程增強菌絲對培養環境的適應性，又起到擴繁的作用。原種可以直接出菇.

栽培種：由原種擴繁而成。主要是為了擴繁，為生產提供足夠的菌種

為了獲得某種真菌類藥材的純菌種，必須從其它微生物中分離出來，稱為菌種的分離。常用的分離方法有下列3 種：

先將所需的野生或家種藥用真菌採集回來，選取新鮮、個體大、壯實、中齡及無病蟲害的子實體（或菌核、菌索），作為分離用的材料。若為子實體，取其菌蓋或菌柄組織；若為菌核，取其全部（如麥角）或部分（如茯苓）菌核；若為菌索，取其部分根狀菌索（如蜜環菌）。再用0.1 %升汞或75 %酒精進行表面消毒2 分鐘，用無菌水（或冷開水）沖洗數次，洗凈殘留的藥液后切成小塊。，然後，放入PDA 培養基的試管或培養皿上，置24 ～26℃溫度下，培養5 ～ 7 天。在分離的真菌組織周圍見長有白色菌絲時，應及時將菌絲移至斜面試管培養基上，再置溫度24 ～26 ℃下培養7～10 天，即得純菌種。所得的純菌種還可繼續擴大培養或保藏。

又可分為以下幾種方法：

( 1 ）褶上塗抹法：選取新鮮、健壯、未開傘、未破裂的子實體，洗凈後用0 . 1 %升汞或75 %酒精表面滅菌2 分鐘，然後連同培養基一起放入接種箱內，經福爾馬林熏蒸消毒12 ～ 24 小時，再按無菌操作技術將接種環在子實體菌褶上塗抹，把塗抹后帶孢子的接種環在培養基上劃線接種，，最後置於25 ～ 28 ℃恆溫箱內培養，可得純菌種。

( 2 ）孢子印採集法：取滅過菌的載玻片、試紙或黑布，置於新鮮、未開傘或未開裂的子體菌褶的下方。經24 小時后，便落下孢子，形成印痕（即孢子印）。然後，用接種環或玻璃棒蘸取孢子，接種在平面或斜面培養基上，進行恆溫培養，可得純菌種。

( 3 ）孢子收集器採集法：孢子收集器由玻璃鐘罩、培養皿、三角架、搪瓷盤等組成。鐘罩下為一搪瓷盤，直徑25 厘米左右，盤內先墊襯4～6 層紗布，中央放1 副9 厘米直徑的培養皿，大蓋口朝下，上放小的，口向上。然後，在上面小的培養皿上放1 只鉛絲繞成的三角架，再將帶孔的玻璃鐘罩蓋上，頂上罩孔用棉塞塞好，最後，用紗布包好整個孢子收集器，置於高壓滅菌鍋或蒸籠內滅菌2小時。

孢子收集器滅菌消毒后，放入無菌室或無菌箱內。然後，用小刀割取1 塊4～5 厘米大小的子實體，插在收集器內的三角架頂上（若無孢子收集器，也可用培養皿代替）。再置於溫度24 ～26 ℃下培養24 小時，培養皿中便可見到白色粉狀物，此即為孢子。此時，可將孢子收集器再移至接種箱內，取出培養皿，蓋好，並在培養皿內加入10 ～ 20 毫升的無菌水，使孢子散於本中，成為孢子懸浮液。然後，再用無菌打針筒或吸管吸取孢子懸浮液，接種於試管斜面培養基上，每管注2 ～ 3 滴。置於24 ～ 26 ℃溫度下培養5 ～ 7 天，培養基上便可長出白色菌落。待菌落直徑有0 . 5 厘米時，選健壯的菌落，再移接於另一試管的斜面培養基上培養。當白色菌絲長滿試管時，便得純菌種。

即從生長有某種真菌的寄主體上（如茯苓、木耳木段）取下木片，進行分離的方法。如木耳制種時，可選野生、朵大、出耳多、質厚的耳棒（即長有木耳的木段）。採集后，削去耳根下的樹皮，將其橫斷面鋸成1 厘米厚的木片，在無菌條件下，切去無耳菌絲部分，留下有耳菌絲部分，浸入0 . 1 %升汞水中1 分鐘，取出再用無菌水衝去木片上的汞液。然後，用解剖刀將木片切成0 . 5 厘米的小塊，放入斜面培養基內，置24 ～26 ℃下培養，及時淘汰雜菌，選取純菌絲進行移植培養，即得菌種。