免疫印跡法

免疫印跡法(Western blotting)是一種將高解析度凝膠電泳和免疫化學分析技術相結合的雜交技術。免疫印跡法具有分析容量大、敏感度高、特異性強等優點，是檢測蛋白質特性、表達與分佈的一種最常用的方法，如組織抗原的定性定量檢測、多肽分子的質量測定及病毒的抗體或抗原檢測等。

免疫印跡法(immunoblotting test,IBT)亦稱酶聯免疫電轉移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB),因與Southern早先建立的檢測核酸的印跡方法 Southern blot 相類似，亦被稱為Western-blot.

1階段 2簡介 3原理

4試劑準備 5操作步驟 6注意事項

階段

原理

免疫印跡法分三個階段進行。第一階段為SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白樣品經SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯醯胺凝膠中從陰極向陽極泳動，分子量越小，泳動速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見（只有在染色后才顯出電泳區帶）.第二階段為電轉移：將在凝膠中已經分離的條帶轉移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1～2A），通電45min轉移即可完成。此階段分離的蛋白質條帶肉眼仍不可見。第三階段為酶免疫定位：將印有蛋白質條帶的硝酸纖維素膜（相當於包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應底物，使區帶染色。常用的HRP底物為3,3'-二氨基聯苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈藍紫色）.陽性反應的條帶清晰可辨，並可根據SDS-PAGE時加入的分子量標準，確定各組分的分子量。本法綜合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，是一個有效的分析手段，不僅廣泛應用於分析抗原組分及其免疫活性，並可用於疾病的診斷。在艾滋病病毒感染中此法作為確診試驗。抗原經電泳轉移在硝酸纖維素膜上后，將膜切成小條，配合酶標抗體及顯色底物製成的試劑盒，可方便地在實驗室中供檢測用。根據出現顯色線條的位置可判斷有無針對病毒的特異性抗體.

簡介

免疫印跡法是將蛋白質轉移到膜上，然後利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。

原理

與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用於檢測蛋白水平的表達。

試劑準備

1、SDS-PAGE試劑：見電泳實驗。

2、勻漿緩衝液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巰基乙醇0.2ml；ddH2O 2.8ml。

3、轉膜緩衝液：甘氨酸2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。

4、0.01M PBS(pH7.4）：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。

5、膜染色液：考馬斯亮蘭0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液（5%脫脂奶粉，現配）：脫脂奶粉1.0g溶於20ml的0.01M PBS中。

6、顯色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸鎳胺0.1ml；H202 1.0μl。

操作步驟

一蛋白質樣品獲得：細菌誘導表達后，可通過電泳上樣緩衝液直接裂解細胞，真核細胞加勻漿緩衝液，機械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然後4℃，13,000g離心15min。取上清液作為樣品。

二電泳：製備電泳凝膠，進行SDS-PAGE。

三轉移：（半乾式轉移）

1、電泳結束后將膠條割至合適大小，用轉膜緩衝液平衡，5min×3次。

2、膜處理：預先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉膜緩衝液中10min。

3、轉膜：轉膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜精確對齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多餘的液體吸干。接通電源，恆流1mA/cm2，轉移1.5hr。轉移結束后，斷開電源將膜取出，割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標準的條帶染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然後用雙蒸水洗，風乾夾於兩層濾紙中保存，留與顯色結果作對比。

四免疫反應：

1、用0.01M PBS洗膜，5min×3次。

2、加入包被液，平穩搖動，室溫2hr。

3、棄包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。

4、加入一抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部），4℃放置12hr以上。陰性對照，以1%BSA取代一抗，其餘步驟與實驗組相同。

5、棄一抗和1%BSA，用0.01M PBS分別洗膜，5min×4次。

6、加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋），平穩搖動，室溫2hr。

7、棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。

8、加入顯色液，避光顯色至出現條帶時放入雙蒸水中終止反應。

注意事項

1、一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經過預實驗確定最佳條件。

2、顯色液必須新鮮配置使用，最後加入H2O2。

3、DAB有致癌的潛在可能，操作時要小心仔細。

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