積層膠
積層膠
積層膠是一個基因表達終極結果是產生相應的蛋白質（或酶）。
目錄
蛋白質的檢測與分析——Westernblot操作步驟
一個基因表達終極結果是產生相應的蛋白質（或酶）。因此檢測蛋白質是測定基因表達的主要標誌，檢測蛋白質的方法很多，除ELISA法外，也可用與檢測DNA和RNA相類似的吸印方法。前兩法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸稱為Western（西）印跡法，該法能用SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分辨出與專一抗血清結合的專一性蛋白質。將聚丙烯醯胺凝膠上分辨出的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上並與第一抗體共孵。第一抗體專一地與待分離蛋自質的抗原決定簇結合，然後用另一種蛋自質，如135I-蛋白A或辣根過氧化物酶連接的山羊抗IgG檢測已結合上去的抗體。本法所需時間6小時或過夜。
(一)蛋白質的聚丙烯醯胺凝膠電泳
幾乎所有蛋白質電泳分析都在聚丙烯醯胺凝膠上進行，而所用條件總要確保蛋白質解離成單個多肽亞基並儘可能減少其相互間的聚集。最常用的方法是將強陰離子去污劑SDS與某一還原劑並用，並通過加熱使蛋白質解離后再加樣於電泳凝膠上。變性的多肽與SDS結合併因此而帶負電荷，由於多肽結合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關，因此SDS多肽複合物在聚丙烯醯凝膠電泳中的遷移只與多肽的大小相關。在達到飽和的狀態下，每克多肽約可結合1.4克去污劑，藉助已知分子量的標準參照物，則可測算出多肽鏈的分子量。
SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳大多在不連續緩衝系統中進行，其電泳槽緩衝液的pH值與離子強度不同於配膠緩衝液，當兩電極間接通電流后，凝膠中形成移動界面，並帶動加入凝膠的樣品中所含的SDS多肽複合物向前推進。樣品通過高度多孔性的積層膠后，複合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區帶（或稱積層）。曲於不連續緩衝系統具有把樣品中的複合物全部濃縮於極小體積的能力，故大大提高了SDS聚丙烯醯胺凝膠的解析度。
最廣泛使用的不連續緩衝系統最早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)設計的，樣品和積層膠中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽緩衝液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分離膠中含Tris-Cl(pH8.8)的。系統中所有組分都含有0.1%的SDS(Laemmli,1970)，樣品和積層膠中的氯離干形成移動界面的先導邊界而甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動界面的兩邊界之間是一電導較低而電位滴度較陡的區域，它推動樣品中的多肽前移並在分離膠前沿積聚，此處pH值較高，有利於甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿過堆集的多肽並緊隨氯離子之後，沿分離膠泳動。從移動界面中解脫后，SDS多肽複合物成一電位和pH值均勻的區帶泳動穿過分離膠，並被篩分而依各自的大小得到分離。
【材料】
分離膠及積層膠溶液
水飽和異丁醇
1×Tris·Cl/SDS,pH8.8
蛋白質分子量標準混合物
1×SDS電泳緩衝液
電泳裝置及夾子、玻璃板、灌膠支架、緩衝液槽等附件
0.75mm封邊墊片
0.75mm樣品梳子
50µl微量進樣器
恆流電源
【常用試劑】
1）30%丙烯醯胺/0.8%N,N’-亞甲丙烯醯胺
將30克丙烯醯胺和0.8克N,N’-亞甲丙烯醯胺溶於總體積為60ml的水中，加熱至37℃溶解之，補加水至終體積為100ml。0.45µm微孔濾膜過濾除菌，查證該溶液pH應不大於7.0，置棕色瓶中保存。
小心：丙烯醯胺具有很強的神經毒性並可通過皮膚吸收，其作用具有累積性。稱量丙烯醯胺和N,N’-亞甲丙烯醯胺時應戴手套和面具。可認為聚丙烯醯胺無毒，但也應謹慎操作，因為它還可能含有少量未聚合材料。
2）4×Tris·Cl/SDS,pH8.8,
在300mlH2O中溶解91gTris鹼(1.5mol/L)，用1mol/L調節pH至8.8,補加H2O至體積500ml。用0.45um濾膜過濾溶液，再加入2gSDS[0.4%(w/v)]，於4℃可保存1月。
3）4×Tris·Cl/SDS,pH6.8,
在40mlH2O中溶解6.05gTris鹼(0.5mol/L)，用1mol/L調節pH至6.8,補加H2O至體積100ml。用0.45um濾膜過濾溶液，再加入0.4gSDS[0.4%(w/v)]，於4℃可保存1月。
4）4×SDS電泳緩衝液
Trisbase24.2g
Glycerin115.3g
20%SDS20ml
加水至總體積1000ml。
應用時稀釋4倍即為1×SDS電泳緩衝液(Tris0.05M,Glycerin0.38M,SDS0.1%)。
5）TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)
TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯醯胺和N,N’-亞甲丙烯醯胺的聚合。
6）10%過硫酸銨
【步驟】
1）按廠商的使用指南用兩塊乾淨的玻璃，平板和0.75mm墊片組裝電泳裝置中的玻璃平板夾層，並固定在灌膠支架上。
2）按表7.1配製分離膠液體並脫氣，然後加入10%的過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌混勻。
聚丙烯醯胺分離膠的配製
試劑成分配製不同濃度分離膠所需試劑(ml)
5%8%10%12%15%
Acry:Bis(30:0.8)2.504.005.006.007.50
4×Tris·Cl/SDS,pH8.83.753.753.753.753.75
H2O8.757.256.255.253.75
10%過硫酸銨0.050.050.050.050.05
TEMED0.010.010.010.010.01
按所需分離的蛋白質分子大小選擇合適的丙烯醯胺百分比濃度，一般地，5%的凝膠可用於60～200kDa的SDS變性蛋白質分子的分離，10%用於16～70kDa，15%用於12～45kDa。
3）用一根巴斯德吸管立即將分離膠液體沿夾層中一條墊片的邊緣加入於玻璃平板夾層中，至凝膠約5cm高為止。樣品體積少於10μl不需灌制積層膠。
4）用另一根已斯德吸管，先從一邊的墊片，再從另一邊墊片往夾層的液面頂部緩緩加入一層水飽和異丁醇（厚約1cm）。讓凝膠在室溫聚合30min。
聚合后，可見在頂層異丁醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線，膠的聚合失敗往往問題在於過硫酸按或TEMED，或兩者都有。
5)傾去頂層的異丁醇，並以1×Tris-Cl/SDS,pH8.8緩衝液沖洗凝膠的頂部表面，盡量用吸水紙吸干。
6)按表7.2配製積層膠液體，用吸管將液體沿一條墊片加入到玻璃平板夾層，直至夾層的頂部。
聚丙烯醯胺積層膠的配製
GEL%（3.9%）Total(10.05ml)
Acry:Bis(30:0.8)1.30ml
4×Tris·Cl/SDS,pH6.82.50ml
H2O6.10ml
10%過硫酸銨0.05ml
TEMED0.01ml
7)將0.75mm厚的梳子插入夾層的積層膠液體中，必要時，再補加積層膠液體充盈剩餘空間。讓積層膠室溫聚合30min。
8)在具螺口蓋的微量離心管中，用2×SDS加樣緩衝液按1:1(v/v)稀釋待測蛋白質樣品，於100℃煮沸5-10min。如樣品是蛋白質沉澱物，加入50～100µl1×SDS加樣緩衝液溶解之，並同樣在100℃煮沸5-10min。按供應商的使用指南用2×SDS加樣緩衝液溶解蛋白質分子量標準混合物。
對於0.3cm寬的加樣孔，推薦加樣體積以不超過20µl為宜。用考馬斯亮藍染色法顯跡，成分很複雜的蛋白質混合物需加25～50µg，而樣品中只有一種或不多的幾種蛋白的話，只需1～10µg蛋白量。採用銀染顯跡時，樣品用量可減小10～100倍（按樣品的複雜程度在小於20µl的體積溶有0.01～0.5ng蛋白樣品不等）。
2×SDS加樣緩衝液(loadingbuffer)配製：
成 分體積(ml)
0.5MTris·Cl(pH6.8)12.5
20%SDS11.5
Glycerin10
2%Blue-Bromo-phenol2.5
β-mercaptoethanol*5.0
加H2O至總體積50ml，分裝
*β-mercaptoethanol在臨用前加入。
9）小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯醯胺凝膠加樣孔。取出梳子后，以1×SDS電泳電泳緩衝液沖洗加祥孔，並以此緩衝液充滿之。
10）按廠商指南將凝膠板固定到電泳裝置的上緩衝液室（上槽），同時往下緩衝液室（下槽）加入推薦量的1×SDS電泳緩衝液。
11）將固定於上槽的凝膠板放入下槽中，並往上槽加入部分電泳緩衝液至剛好淹沒凝膠的加樣孔。
12）用帶平嘴針頭的50µl注射器將同樣濃度的蛋白質樣品等體積加入到樣品孔中，小心加樣使樣品在孔的底部成一薄層，對照孔加入蛋白質分子量標準樣品，如有空置的加樣孔，須加等體積的空白1×SDS樣品緩衝液，以防相鄰泳道樣品的擴散。
13)再往上槽加入餘下的1×SDS電泳緩衝液。此操作緩慢小心，以防衝起樣品孔中的樣品。
14）連接電源，對於0.75mm厚的垂直板電泳，先在60V下電泳至溴酚藍染料從積層膠進入分離膠，再將電壓調至120V繼續電泳至溴酚藍到達凝膠底部為止。
15）關閉電源並撤去連接的導線，棄去電泳緩衝液。連同上槽一起將凝膠夾層取出。
16）將凝膠定位以便識別加樣的順序，將凝膠板從上槽解離出來，放在一疊吸水紙或紙巾上。
17）小心將封邊的墊片抽出一半，並以此為槓桿橇起上面的玻璃平板，使凝膠暴露出來。
18）小心從下面的玻璃平板上移出凝膠，在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及干膠后仍能認出加樣次序，接著就可進行蛋白質的檢測。
(二)蛋白質從SDS聚丙烯醯胺凝膠轉移至固相支持體
目前進行的Western印跡反應大多還是從凝膠上直接把蛋白質電轉移至硝酸纖維素濾膜之上。把凝膠的一面與硝酸纖維素濾膜相接觸，然後將凝膠及與之相貼的濾膜夾於濾紙、兩張多孔墊料以及兩塊塑料板之間。把整個結合體浸泡於配備有標準鉑電極並裝有pH8.3的Tris-甘氨酸緩衝液的電泳槽中，使硝酸纖維素濾膜靠近陽極一側，然後接通電流約0.5小時。在此期間，蛋白質從凝膠中向陽極遷移而結合下硝酸纖維素濾膜上。為了防止過熱並因而導致在夾層中形成氣飽，轉移過程應在冷室中進行。
【步驟】
1）當SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳行將結束時，用蒸餾水淋洗電極板，然後用不被吸收的紙巾揩乾電極板上粘附的液滴。
2）戴上手套，切6張濾紙和1張硝酸纖維素濾膜，其大小都應與凝膠大小完全吻合。如果濾紙或濾膜面積大於凝膠，濾紙和濾膜伸出的邊緣就大有機會相接觸，造成電流短路而使蛋白質不能從凝膠向濾膜轉移。用鉛筆在濾膜一角作好標記。拿取凝膠、濾紙和硝酸纖維素濾膜時必須戴手套。因為皮膚上的油脂和分泌物會阻止蛋白質從凝膠向濾膜轉移。
3）把硝酸纖維素濾膜漂浮於一盤去離子水的水面上，借毛細作用使之從下往上濕潤后，將之浸沒於水中，浸泡5分鐘以上以驅除留於濾膜上的氣泡。
4）在一淺托盤中加入少量轉移緩衝液，把6張濾紙浸泡於其中。
轉移緩衝液
190mmol/L甘氨酸
25mmol/LTris鹼
20%甲醇
配製IL轉移緩衝液，需稱取14.4g甘氨酸、3gTris鹼，並加入200ml甲醇，加水至總量為1L。
5）戴上手套按如下方法安裝轉移裝置：
a.平放底部電極（陰極），放一張海綿墊片。
b.在海綿墊片上放置3張用轉移緩衝液浸泡過的濾紙，逐張疊放，精確對齊，然後用一玻璃移液管作滾筒以擠出所有氣泡。
d.從電泳槽上撤出放置SDS聚丙烯醯胺凝膠的玻璃，把凝膠轉移到一盤去離子水中略為漂洗一下，然後準確平放於硝酸纖維素濾膜上。把凝膠左下角置於硝酸纖維素濾膜的標記角上，戴手套排除所有氣泡。切記：為避免發生短路，不要切去凝膠的左下角。
c.把硝酸纖維素濾膜放在聚丙烯醯胺凝膠上，要保證精確對齊，而且在硝酸纖維素濾膜與聚丙烯醯胺凝膠之間並不留有氣泡。
e.把最後3張3濾紙放在硝酸纖維素濾膜上方，同樣須確保備層精確對齊並不留氣泡。
6）將靠上方的電極（陽極）放於夾層物上，連接電源。根據凝膠面積按300mA接通電流，電轉移0.5-1.0小時。
7）斷開電源並拔下槽上插頭，從上到下拆卸轉移裝置，逐一掀去各層。將凝膠轉移至盛有考馬斯亮藍染液的托盤中，進行染色，以便檢查蛋白質轉移是否完全。
8）可做可不做：取出硝酸纖維素濾膜置於一張乾淨的濾紙上，於室溫乾燥30－60分鐘，使硝酸纖維素濾膜乾燥，據稱可以改善濾膜在隨後的處理中保留蛋白質的能力；但是，這也可能導致蛋白質進一步變性並因此改變其免疫反應性，所以乾燥濾膜對某些蛋白質/抗體組合來說可能是優點，但對另一些組合則可能是缺點，此一時而彼一時，只能針對具體靶蛋白根據實驗來決定。
9）切去濾膜的左下角，以免鉛筆標記被抹去。
(三)對固定於硝酸纖維素濾膜上的蛋白質進行染色
可供對固定於硝酸纖維素濾膜上的蛋白質進行染色的方法有多種，但僅有麗春紅S染色法可與所有免疫學檢測方法兼容，這是因為該染料只會短暫顯色而且在進行Western印跡時可被洗去。因此，麗春紅S染色並不影響隨後用於檢測抗原的顯色反應，這些顯色反應是由已偶聯抗體的鹼性磷酸酶或乳過氧化物酶等催化的。然而，由於其顯示的紫紅色不容易拍攝下來，這種染色不能提供永久性實驗記錄，而只能提供蛋白質轉移情況的直觀證據並對蛋白質分子量標準參照物進行定位，標準蛋白在硝酸纖維秦濾膜上的位置可用鉛筆或不褪色的墨水標記下來。
【步驟】
1）如果硝酸纖維素濾膜已干，則把它漂浮於一盤去離子水的水面上，通過毛細作用使濾膜自下而上濕潤。然後把濾膜浸泡於水中，浸泡5分鐘以上以驅除留於其上的氣泡。
2）把濾膜轉移到含有麗春紅S使用液的托盤中染色5-10分鐘，其間輕輕搖動染液。
混合下列成分，配成麗春紅S貯存液(10×)：
麗春紅S2g
三氯乙酸30g
磺基水楊酸30g
加水至100ml
用1份上述貯存液加9份去離子水即成麗春紅S使用液，使用后應予廢棄。
3）蛋白帶出現后，於室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，其間換水數次。
4）用防水性印度墨汁標出作為分子量標準的參照蛋白的位置。
(四)封閉硝酸纖維紊濾膜的免疫球蛋白結合位點
正如從SDS聚丙烯醯胺凝膠轉移出來的蛋白質可以與硝酸纖維素濾膜結合一樣，免疫學檢測試劑中的蛋向質同樣也能與之結合。Western印跡法的靈敏度取決於封閉可能結合非相關蛋白的位點以降低這類非特異性結合背景的效果。現已設計的封閉液有多種，其中脫脂奶粉最為價廉物美，既使用方便又可與通常使用的所有免疫學檢測系統兼容。只有一種情況，也就是當牛奶中可能含有要用Westem印跡法檢測的蛋白質時，不能使用脫脂奶粉作為封閉劑。
【步驟】
1）把硝酸纖維素濾膜放入可以加熱封接的塑料袋中，根據濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入封閉液，儘可能排除裡面的氣泡，然後密閉袋口，平放在平緩搖動的搖床平台上於室溫溫育1小時。
封閉液
0.25%(w/v)卡塞因(Caesin)
0.01%疊氮鈉（小心：疊氮鈉有毒，使用時應戴手套謹慎操作，含有疊氮鈉的溶液應標記清楚。）
溶於pH7.4的PBS中。
如果免疫探針的非特異結合背景仍然太高以致難以接受，可加入Tween-20至終濃度為0.02%。在大多數情況下，加入這種去污劑不至影響抗體與靶抗原的特異性結合。
2）剪開塑料袋，棄去封閉液，立即加入抗靶蛋白杭體溶液與濾膜一同溫育。
(五)抗體和靶蛋白的結合
實際上，Western印跡膜的檢測分兩步進行：首先靶蛋白特異性的非標記抗體在封閉液中先與硝酸纖維素濾膜一同溫育。經洗滌后，再將濾膜與二級試劑——放射性標記的或與辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶偶聯的抗免疫球蛋白抗體或A蛋白一同溫育。進一步洗滌后；通過放射自顯影或原位酶反應來確定抗原-抗體-抗體或抗原-抗體-A蛋白複合物在硝酸纖維素濾膜上的位置。
間接法即兩步檢測法的主要優點是使用單個二級試劑則可測定多種多樣的第一抗體，從而免卻了逐一純化並標記各種第一抗體之累。因為向廠商購置的二級免疫試劑，價格頗為低廉，所以可大大節約時間和金錢。
1．用抗靶蛋白的第一抗體與硝酸纖維素濾膜共溫育的方法
1）在裝有用上頁所述方法處理過的硝酸纖維素濾膜的塑料袋中，按每平方厘米0.1ml的量加人封閉液和適量的第一抗體。
應進行預實驗並按實際情況確定第一抗體的加量，推薦使用以下稀釋度：
a.多克隆抗體：1:100－1:5000。
b.雜交瘤細胞培養上清液：不稀釋一1:100。
c.雜交瘤小鼠的腹水：1:1000—1:10,000。
2）儘可能排除藏匿的氣泡后密封袋口，將臆膜平放在乎緩搖動的搖床平台上，於37℃溫育1~2小時。
3）剪開塑料袋，廢棄封閉液和抗體，用25mlPBS漂洗濾膜3次，每次10分鐘。
4）按下面介紹的方法，立即用二級免疫試劑與濾膜一同溫育。
2．用二級免疫試劑與硝酸纖維素膜溫育的方法
二級試劑（通常是抗兔疫球蛋白抗體或A蛋白）可用125I進行放射性標記，也可與辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶共價偶聯。與酶共價偶聯的免疫球蛋白和A蛋白均有商品出售。
(1)酶聯二級試劑
1）經PBS最後一次洗滌后，把硝酸纖維素濾膜轉移到裝有PBS溶液的托盤中，於室溫平緩搖動溫育10分鐘。切記在加入酶聯第二試劑之前須清除濾膜上的疊氮鈉。
2）把濾膜轉移至一個可以加熱封接的塑料袋，按濾膜面積加入0.1ml/cm2無疊氮鈉的封閉液。
3）根據廠家說明書加入酶聯二級試劑，如果使用塑料袋則應予封口。二級試劑的稀釋度一般推薦用1:200－1:2000。
4）於37℃平緩搖動、將濾膜與酶聯二級試劑一同溫育1小時。
5）把濾膜轉移至PBS溶液。於室溫平緩擺動，溫育10分鐘。重複3次，每次更換新的PBS溶液。
6）按下文介紹的方法加入合適的生色底物。
3．酶聯抗體生色底物的使用
(1)鹼性磷酸酶經免疫反應固定的鹼性磷酸酶可催化底物5-溴-4-氯-3-吲跺磷酸/氮藍四唑（BCIP/NBT）在原位轉變為深藍色化合物。
1）配製下列3種溶液：
NBT在10ml70%的二甲基甲醯胺中溶解0.5gNBT。
BCIP在10ml100%的二甲基甲醯胺中溶解0.5BCIP。
鹼性磷酸酶緩衝液
100mmol/LNaCl
5mmol/LMgCl2
100mmol/LTris-Cl（pH9.5）
放在密閉容器中保存於室溫，這一溶液是穩定的。
2）取66µlNBT溶液與10ml鹼性磷酸酶緩衝液混勻，加入33µlBCIP溶液。這一生色底物混合液應在30分鐘內使用。
3）把經洗滌的硝酸纖維素濾膜[本頁頁首步驟5]轉移至一淺托盤上，按濾膜面積加入0.1ml/cm2的生色底物混合物，於室溫平緩搖動進行溫育。
4）細心觀察反應過程，一俟蛋白帶的顏色深度達到要求（約20分鐘），則把濾膜移到另一托盤中，內裝有200µl0.5mol/LEDTA（pH8.0）和50mlPBS。
5）拍攝濾膜照片留作永久實驗記錄。
(2)辣根過氧化物酶免疫偶聯的辣根過氧化物酶最敏感的底物是3,3'-二氨基聯苯胺，它在過氧化物酶所在部位轉變成棕色沉澱。在鈷或鎳離子存在下進行反應可以加深沉澱的顏色並提高反應的靈敏度。但是，使用辣根過氧化物酶不可能完全排除背景顏色，因此須十分小心地觀察生色反應，一俟特異性染色蛋白帶清晰可見，就應儘快終止生色反應。
1）在9ml的0.0lmol/LTris-Cl（pH7.6）溶液中溶解6mg的二氨基聯苯胺（臨用前配製）。
2）用濾紙過濾底物溶液以去除可能形成的沉澱物。
3）加入10µl30%H202，混勻后立即使用。得到的30%H2O2溶液，應保存於密閉的棕色瓶中，數周后應予廢棄。
4）把經漂洗的硝酸纖維素濾膜移至一淺托盤上，按濾膜面積加入0.1ml/cm2的底物溶液，於室溫輕輕搖動溫育之。
5）細心觀察反應過程，一俟蛋白帶的顏色深度達到要求（約1-3分鐘），即用水略為漂洗，然後把濾膜轉移到PBS中。
6）拍攝濾膜照片，留作永久實驗記錄。過氧他物酶染色的蛋白帶經日光照射數小時后將褪去顏色。