融合蛋白

在基因操作中，對一些分子數小的多肽基因常採用融合的方法與某一基因（如lac）相連，二者之間接上某一酶（如凝血酶）的切口，以增加在體內表達后產物的穩定性，也有的故意使兩個分子串連融合以提高療效，如IL-3與GM-CSF。也有與分泌性蛋白的信號肽基因組成融合基因，以使表達產物分泌到膜外或胞外。

融合蛋白-技術概況融合蛋白技術是為獲得大量標準融合蛋白而進行的有目的性的基因融合和蛋白表達方法。利用融合蛋白技術，可構建和表達具有多種功能的新型目的蛋白。

融合基因可在原核細胞(如大腸桿菌)也可在真核細胞中進行表達。

原核表達系統的特點是時程短，費用低，是科研中的主要工具。其缺點是真核蛋白表達沒有得到確切修飾；大量蛋白常常沉澱成不溶性包涵體聚合物，需要複雜的變性和復性過程；大量蛋白的分泌較困難。真核表達系統的特點是蛋白翻譯后加工機會多，甚至可被改造成人源型；真核細胞易被轉染，具有遺傳穩定性和可重複性；產物可被分泌，提純簡單，成本低。

基於重複結構的融合蛋白大多為短肽，不具有複雜的空間結構，因此只需簡單的多肽合成過程即可獲得目標蛋白。由單個氨基酸合成多肽主要通過兩個氨基酸之間脫水形成肽鍵來實現，主要包括以下基本步驟:：首先對兩性離子結構的氨基酸進行相應的氨基或羧基保護，其次將羧基活化為活性中間體，待耦合過程結束后，對肽鏈上氨基酸的保護基團選擇相應的方式進行選擇性的脫除或者是全脫除。目前常用的多肽合成方法為液相合成和固相合成兩種。液相合成法是將所需的氨基酸配製成溶液，並對其中一個氨基酸的氨基、其餘氨基酸的羧基和不參與反應的側鏈基團進行化學基團保護，只活化參加反應的氨基酸的羧基，待耦合反應完成後再將沒有參加反應的原料、活化劑等分離除去，得到純化多肽產物。這種方法雖然操作繁瑣，卻具有目標產物純度高的優勢。而固相合成法，則是將多肽序列C端的第1個氨基酸的羧基通過酯化反應固定於不溶性的樹脂上，進而以此氨基酸作為氨基組分，脫除其氨基保護基團並同過量的活化后的羧基組分耦合形成肽鍵，重複脫保護、縮合、洗滌過程持續合成，獲得所需的肽鏈。合成完成後，再試用三氟乙酸將產物從樹脂上切割下來，同時脫除所有保護基團，純化回收穫得所需多肽。

相對來說，具有一定空間結構且序列複雜的其他兩種融合蛋白的合成過程則複雜得多。精確構建所需DNA模版是保證融合蛋白多樣性及穩定性的基礎。在獲得目標DNA序列后，將其連接進入特定的載體之中，以獲得充足融合蛋白質粒。由於遺傳基因的簡併性，同一種融合蛋白可對應著多種DNA序列，但序列合成蛋白效率卻與擴增時選取的宿主種類有關( 大腸桿菌、酵母菌及真核細胞等)。例如，“AAG及AGA”片段如果出現在需要使用大腸桿菌表達體系的質粒中便會大大影響蛋白產率。重組質粒中密碼子的優化還有許多影響因素，密碼子偏倚、tRNA可用性、mRNA穩定性和mRNA結構都在基因表達中起重要作用，而且選擇DNA片段時也應盡量避免在重組基因載體中存在高度重複的部分以避免發生錯配，影響mRNA轉錄。

構建融合蛋白的基本原則是，將第一個蛋白的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第二個蛋白基因，以實現兩個基因的共同表達。具體步驟有：

1.進行目的基因的克隆：根據基因序列互補原則，設計合適的引物序列，以cDNA為模板，利用PCR技術擴增不同的目的DNA片段。

2.在載體中進行重組：通過限制內切酶將兩個DNA片段進行酶切並回收，然後通過連接酶將兩個具有相同末端酶切位點的基因片段進行體外連接，並克隆到高表達質粒載體中，構建重組質粒。

3.將重組表達載體轉染宿主細胞並利用選擇標誌進行篩選及測序。

4.融合基因的誘導表達及表達蛋白的純化。

在構建融合蛋白中，一個關鍵的問題是兩蛋白間的接頭序列(Linker)，即連接肽。它的長度對蛋白質的摺疊和穩定性非常重要。如果接頭序列太短，可能影響兩蛋白高級結構的摺疊，從而相互干擾；如果接頭序列太長，又涉及免疫原性的問題，因為接頭序列本身就是新的抗原。

一般來說，3-5個氨基酸的Linker可滿足大部分融合蛋白的正確摺疊的要求。有人嘗試在融合蛋白間加入一段有疏水性和一定伸展性的較長肽鏈，如(Gly4Ser1)，目的是將兩者分開，以緩解相互干擾作用，並獲得了滿意的結果。但具體涉及到每種蛋白時，需具體分析。當我們構建融合蛋白時，應多選擇幾種融合方式，從中優化出理想的連接方式。另外，大量研究表明連接肽的柔性和疏水性對不擾亂蛋白質的功能結構域是十分重要的。

遺憾的是，目前對於連接肽序列的設計還沒有可靠的選擇標準。現在，大多數連接肽序列的設計和選擇仍主要依賴於直覺。儘管依賴於蛋白質的一級結構來預測其二級結構已經產生了重大的進步，但是我們對於序列和結構之間的關係的了解還是很有限的。

構建融合蛋白的基本方法是將具有特定功能的天然或人工編碼的多肽序列模塊化，並使用基因編碼的DNA序列模板合成，隨後將第1個蛋白的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第2個蛋白基因，以實現兩個基因的共同表達。通過控制每一個功能肽模塊在整體蛋白材料中的確切位置和密度，人們便能夠根據實際需要改變融合蛋白的組成。

融合蛋白的設計大致分為基於重複結構、基於生長因子以及基於細胞粘附分子3類。第1類融合蛋白中最典型的是來源於彈性蛋白(Elastin-Like Polymers，ELPs)及絲素蛋白(Silk-Like Polymers，SLPs) 的融合蛋白。ELPs是一種由數個重複的氨基酸序列組成的細胞外基質蛋白，由兩種短肽段交替排列構成，主要包括VPGZG、VPGVG、APGVGV、VPGFGCGAG以及VPGG等5種。最著名的當屬VPGZG融合蛋白(Z可換為除了脯氨酸外任意氨基酸)。重複的VPGVG序列能夠使融合蛋白具有溫敏特性，將溫敏性ELP與化學、酶、物理等多種交聯方式的水凝膠結合起來能夠衍生出多種應用方式。ELPs主要由甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸組成，極易形成反向平行的β－摺疊片層結構，具有多樣側鏈化學修飾位點，良好的熱穩定性和機械性能，在生物醫學上常用作手術縫合線，人工皮膚及軟骨修復材料。對於此類融合蛋白，只需通過調節其氨基酸序列和分子鏈長度，便能夠精確控制其對溫度、pH、離子強度的響應敏感性，從而實現可逆的溶解轉變。

1、DNA疫苗

目前，疫苗已經經歷了三代：第一代疫苗是用減毒或殺死的病原體來激活機體免疫系統；第二代疫苗是用生物技術和重組DNA技術研製的組分疫苗注射機體誘導免疫應答；第三代疫苗是直接注射基因重組的抗原基因來激活人體免疫系統，即DNA疫苗。

DNA疫苗與傳統疫苗相比有著明顯的優勢，如易於生產，穩定性強，成本低廉等，並可同時誘導體液與細胞免疫應答。

目前利用基因工程成功製成的多價重組抗體融合蛋白CYF196(國內尚未上市)就是一種DNA疫苗，它能有效防治下呼吸道感染和哮喘。因為CYF196對病毒的主要受體-位於呼吸道上皮中的細胞間黏附分子有高度親和力，對鼻病毒感染有較強的防禦功能。

2、雙功能酶（多功能酶）

以往研究發現，在利用基因融合所構建的大的酶分子中，如果用以構成融合蛋白的各個酶分子的整個編碼序列均保留於新的酶分子中，則融合蛋白一般均保留所構成的酶分子各自的酶活性。

並且徠發現在這些新構建的融合蛋白中，蛋白的正確摺疊以及各個酶的活性部位均未受到影響，與單個酶相比，融合蛋白的酶的比活力為50%-100%，對於催化連續反應的兩種或幾種酶，利用基因融合的方法構成的融合蛋白可產生“ 鄰近效應”（proximity effect）。

目前研究發現，β-半乳糖苷酶-半乳糖脫氫酶融合蛋白在一定條件下，其偶聯反應產生NADH的速度是同時加入這兩種酶的反應速度的兩倍以上。同時過渡態時間縮短近四倍。

3、定向藥物

定向藥物一般由兩部分組成：一部分是藥物；另一部分是可以與病灶特異性結合的配基。通過融合蛋白技術將這兩部分融合在一起，即可構成一個具有獨特構象與功能的蛋白質。

4、基因表達

基因融合技術最早即是被用來在細菌（主要是大腸桿菌）中表達外源蛋白，如somatostatin4、insulin5等，對於外源基因（尤其是真核基因），利用融合表達的方法在大腸桿菌中表達有很多優點，一是由於外源基因一般是被連接到可供融合的蛋白的C端編碼序列之後，因此不需另外設計SD序列，同時，N端融合基因的存在，使得外源基因的表達相對比較容易。其二是外源基因的表達產物常常會被宿主細胞的蛋白酶所降解，當外源基因與宿主本身的某種蛋白如β-半乳糖苷酶的部分編碼序列構成融合基因，以融合蛋白的形式表達時，往往會減低宿主細胞對產物的降解。

DNA疫苗目前，疫苗已經經歷了三代：第一代疫苗是用減毒或殺死的病原體來激活機體免疫系統；第二代疫苗是用生物技術和重組DNA技術研製的組分疫苗注射機體誘導免疫應答；第三代疫苗是直接注射基因重組的抗原基因來激活人體免疫系統，即DNA疫苗。

DNA疫苗與傳統疫苗相比有著明顯的優勢，如易於生產，穩定性強，成本低廉等，並可同時誘導體液與細胞免疫應答。

目前利用基因工程成功製成的多價重組抗體融合蛋白CYF196(國內尚未上市)就是一種DNA疫苗，它能有效防治下呼吸道感染和哮喘。因為CYF196對病毒的主要受體-位於呼吸道上皮中的細胞間黏附分子有高度親和力，對鼻病毒感染有較強的防禦功能。

雙功能酶（多功能酶）以往研究發現，在利用基因融合所構建的大的酶分子中，如果用以構成融合蛋白的各個酶分子的整個編碼序列均保留於新的酶分子中，則融合蛋白一般均保留所構成的酶分子各自的酶活性。

並且發現在這些新構建的融合蛋白中，蛋白的正確摺疊以及各個酶的活性部位均未受到影響，與單個酶相比，融合蛋白的酶的比活力為50%-100%，對於催化連續反應的兩種或幾種酶，利用基因融合的方法構成的融合蛋白可產生“鄰近效應”（proximity effect）。

目前研究發現， β-半乳糖苷酶-半乳糖脫氫酶融合蛋白在一定條件下，其偶聯反應產生NADH的速度是同時加入這兩種酶的反應速度的兩倍以上。同時過渡態時間縮短近四倍。

定向藥物定向藥物一般由兩部分組成：一部分是藥物；另一部分是可以與病灶特異性結合的配基。通過融合蛋白技術將這兩部分融合在一起，即可構成一個具有獨特構象與功能的蛋白質。

免疫球蛋白（Ig）融合蛋白

免疫球蛋白融合蛋白是指在基因水平將目的基因同Ig部分片段基因相連，並在真核或原核細胞中表達出的具有上述兩部分結構域的重組蛋白。據目的蛋白與Ig不同片斷相連，可將其分為二大類：一類為Fab(Fv)融合蛋白；另一類為Fc融合蛋白。

甲狀旁腺激素（PTH）融合蛋白

甲狀旁腺激素(Parathyroid Hormone，PTH)是由甲狀旁腺主細胞合成和分泌的一種單鏈多肽激素，成熟PTH含84個氨基酸殘基，分子量約為9500，是人體內調節鈣磷代謝及骨轉換的最為重要的激素之一。它主要通過作用於靶細胞膜上腺苷酸環化酶系統，增加胞漿內cAMP及焦磷酸鹽(PPi)的水平來發揮作用。

細胞因子重組融合蛋白

細胞因子重組融合蛋白是一類利用基因工程的方法將編碼細胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列連接並表達相應蛋白質融合產物。其結構特點為將細胞因子功能活性域與其他分子的活性域融合，各組分可發揮協同作用，使融合蛋白的生物學活性較各單體大大增強。