整合酶

研究人員也許找到了對付艾滋病病毒（HIV）的新方法，那就是抑制一種被稱為“整合酶”的HIV酶，研究人員正在試驗一種新的藥物，這種藥物可以抑制“整合酶”，通過在猴子身上試驗，發現這種藥物可以控制艾滋病的傳染。

HIV-1整合酶是逆轉錄病毒複製的必需酶，它催化病毒DNA與宿主染色體DNA的整合，而且在人類細胞中沒有類似物，因此成為治療艾滋病的富有吸引力和合理的靶標。

一大批HIV-1整合酶抑製劑被鑒定出來，其中一些化合物顯示選擇性的抑制HIV-1整合酶和阻斷病毒複製的活性，而最有影響的兩類抑製劑是含鄰苯二酚的多羥基芳環化合物和最近報道的芳基β-二酮酸類化合物。

抗HIV新葯的不同種類的化合物種類有，包括苯並咪唑類衍生物、核苷類、多肽、羥基取代的芳環化合物及二酮酸類化合物等。

抑製劑的研究開發

由默克科學家們開發的艾滋病病毒1型(HIV-1)整合酶抑製劑，2003年3月在美國和比利時開始進入臨床I期研究，對象為未曾感染HIV的志願者。臨床I期研究是人體實驗的最初階段，主要目的是評估研究藥物的安全性、耐受性及葯代動力學(血液中藥物代謝水平)。據美國默克公司感染性疾病與疫苗臨床研究部副總裁Jeffrey Chodakewitz醫學博士說，迄今為止，有為數不多的健康志願者(不到70人)參與了研究，他們對藥物總體耐受性良好。他注意到現有的臨床前數據支持每天2次劑量，假如一切研究都能順利進行，確定適宜的給藥劑量仍需要通過臨床研究。

刊登在2004年7月8日《科學》雜誌上的一份研究文章指出，Merck公司報告說，當猴子被艾滋病病毒感染初期服用這種葯，就可以對猴子起到明顯的保護作用，因而這種葯又被稱為“整合酶”抑製劑，這種葯對病重者也有效果。Merck公司還在研究數種“整合酶”抑製劑，他們用幾個志願者進行試驗，以便確定這些葯是否安全，是否會對濾過性病毒具有抑制作用。

一種新型整合酶抑製劑高通量篩選方法

隨著HIV-1病毒耐藥性的不斷升級，抗艾滋病藥物的研發遠遠滯后，抗HIV-1藥物新靶點的發現和創新藥物的研發已成為燃眉之急。HIV-1整合酶催化病毒cDNA與宿主細胞基因組的整合，是HIV病毒複製周期中必需的關鍵酶。人體內無整合酶功能類似物。因此，整合酶是抗艾滋病藥物研發的理想靶點。

近年來，北京工業大學生命科學與生物工程學院王存新教授領導的分子設計與蛋白質功能實驗室，在兩項國家自然科學基金和五項北京市項目的資助下，在北京工業大學“211工程”項目的大力支持下，致力於以HIV-1整合酶和gp 41蛋白為主要靶標的藥物設計與篩選工作，取得了顯著的成果。該課題組於2008年3月在《中國藥理學報》（Acta Phamarcologica Sinica, 29 (3): 397-404）上發表了關於整合酶抑製劑篩選方法的最新研究成果：利用磁珠建立的一種新型高通量整合酶鏈轉移反應抑製劑篩選方法（A novel high-throughput format assay for HIV-1 integrase strand transfer reaction using magnetic beads）。該工作引入了磁珠捕獲DNA技術代替傳統的DNA包被微孔板方法，對DNA進行修飾加工，通過整合酶催化DNA鏈轉移反應建立了高通量的整合酶活性檢測方法，並基於這種方法篩選了以整合酶為靶點的HIV抑製劑，建立了一種分子水平的整合酶抑製劑篩選平台。這種篩選方法摒棄了傳統放射自顯影方法的具有放射性污染和難以實現高通量篩選等缺點，改進了傳統的酶聯免疫檢測法（ELISA）包被、封閉微孔板等耗時耗力等缺點。該方法靈敏度高，特異性好，且方便、快速，能用於高通量篩選。因此，能夠大大減少藥物篩選的工作量。該方法可以推廣應用到從事藥物研發的科研單位和公司企業中，以創造更高的社會價值。

這項研究的題目是：“A novel high-throughput format assay for HIV-1 integrase strand transfer reaction using magnetic beads”（“利用磁珠建立的一種新型高通量整合酶鏈轉移反應抑製劑篩選方法”）。

人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV）包括HIV-1和HIV-2兩種，其中HIV-2主要分佈於非洲西部，而HIV-1則廣泛分佈於世界各地，是引起全世界AIDS流行的病原。HIV複製周期中的整合過程是將HIV-1 DNA整合入宿主DNA的過程，也是HIV-1複製周期的不可缺少的過程。HIV-1整合酶(integrase,IN)參與整合全過程，催化整個整合反應，是HIV-1複製過程必不可少的酶，也是病毒穩定感染必不可缺的酶。因此抑制該酶活性將能有效的抗HIV-1，所以許多艾滋病研究人員將IN作為研發新藥物的靶點。但由於HIV-1 IN溶解困難等方面的原因限制了對此酶的了解，因此獲得可溶性IN是進行其活性研究，以及為篩選抗HIV藥物提供了重要幫助。

可溶性表達--由於外源蛋白在表達過程中容易被宿主細胞蛋白酶降解或者形成包涵體，而包涵體體外復性過程往往費時、費力，且不經濟，因此外源蛋白在大腸桿菌或者畢赤酵母中的可溶性表達具有較高的學術價值和經濟價值。

pET-28a--來自Novagen公司出產的產品pET系列，主要特徵是

pET-28a: Kan T7lac His-tag(N-terminal tag和optional C-terminal tag） T7-tag(internal tag) protease(thrombin)

據Chodakewitz博士說，默克計劃在2002年下半年對少數HIV感染的志願者開始臨床I期研究。試驗中的HIV-1整合酶抑製劑的臨床研究項目希望涉及比較廣泛的人群，包括那些從未接受過抗逆轉錄病毒治療的患者，以及已經對其它治療產生耐葯的患者，以評估該藥物的療效和耐受性。假如進行的臨床I期研究的結果理想，默剋期望在2003年開始臨床Ⅱ期研究。

美國默克公司致力於開發具有突破意義的HIV/AIDS治療藥物及疫苗的研究已經長達15年，迄今仍在不斷努力。除了努力開發HIV-l整合酶抑製劑之外，美國默克公司正致力研究HIV疫苗，研究方向是既保護人們免受感染，也用於治療HIV患者。已有兩種HIV研究疫苗進入臨床I期研究。

整合酶抑製劑是全新的HIV/艾滋病(AIDS)治療藥物，可能成為抗逆轉錄病毒藥物治療中有重要意義的突破。HIV複製過程需要3種酶：蛋白酶、逆轉錄酶和整合酶。已有藥物能夠抑制前2種酶，即蛋白酶和逆轉錄酶。但還未批准通過的抑制整合酶的藥物。

默克生物化學部常務主任兼HIV-1整合酶抑製劑開發組副組長Daria Hazuda博士說：“根據臨床前研究，研究中的HIV-l整合酶抑製劑可能與逆轉錄酶抑製劑或蛋白酶抑製劑均有協同作用。假如臨床試驗能夠證實這一藥物與其它各類的抗逆轉錄病毒藥物聯合用藥能夠有效的話，它將會對抗逆轉錄病毒治療做出有價值的補充”。

在抗艾滋病的機理上，S—1360是通過抑制艾滋病病毒的整合酶來控制病毒對細胞的感染。整合酶、逆轉錄酶和蛋白酶是艾滋病病毒感染細胞並進行複製所必需的3種酶，現存的所有抗艾滋病藥物都是破壞逆轉錄酶或蛋白酶功能的，對整合酶卻“秋毫不犯”。因此，研製公司稱S－1360實現了一個機理上的突破，它擴大了抗艾滋病藥物的選擇範圍，可能在其它藥物的輔助下更好地控制艾滋病病毒在人體中的複製，從而完善艾滋病的治療。

HIV-1整合酶是HIV病毒複製中一個重要的酶，也是治療艾滋病藥物的一個重要靶點。為了開展以整合酶蛋白為靶點的抑製劑篩選，構建HIV?1整合酶重組質粒，在原核細胞中進行可溶性表達和功能研究。通過重疊PCR技術引入F185K和C280S突變於HIV-1 B亞型標準株的整合酶cDNA片段中，PCR擴增片段克隆到pET-28a(+)表達載體中，構建重組質粒，在E. coli中進行整合酶基因表達，SDS-PAGE鑒定表達產物，親和層析純化蛋白，酶聯免疫吸附實驗方法測定整合酶的生物學活性。結果構建的重組質粒獲得高效穩定的可溶性表達，ELISA實驗證實該蛋白具有整合酶的3′切割DNA和5′鏈轉移的活性。HIV-1整合酶蛋白的可溶性表達和活性研究為建立以整合酶為靶點的抗HIV藥物篩選平台打下了基礎

雖然的聯合用藥是高效的，但由於多重耐葯病毒株的擴散、治療持久性不夠以及長期用現有的抗逆轉錄病毒藥物治療所帶來的副作用等因素，都支持需要增添新的治療選擇。

據估計，在所有接受抗逆轉錄病毒藥物治療的病人中，>78%的患者對一類以上的治療藥物產生耐葯。耐藥性問題在未曾接受過抗逆轉錄病毒治療的患者中也愈加嚴重。在未曾接受過藥物治療的患者中，攜帶耐藥性病毒株的比例已從1999年的5%上升到了現在的20%。在動物實驗中，默克的藥物對於高度突變、多重耐葯的HIV-l治療有效。

儘管對於HIV/AIDS治療已經有多種藥物，AIDS流行仍然猖撅。估計在全世界約有4000萬人感染了HIV，其中>95%在發展中國家。AIDS是導致死亡人數最多的傳染性疾病，年導致300萬人死亡。

科學家破解整合酶的三維結構

英國和美國研究人員在2010年1月31日的《自然》雜誌上報告說，他們合作進行的一項最新研究模擬出整合酶的三維結構。整合酶在包括艾滋病病毒等逆轉錄酶病毒中可以找到，並且充當了艾滋病病毒在人體內複製時的“幫凶”。這項重大突破有助於科學家解決困擾了艾滋病研究領域長達20年的一個難題，從而找到更好的治療艾滋病的方法。

當艾滋病病毒感染人體時，通常會利用整合酶當工具，將病毒的遺傳信息“複製粘貼”到其DNA中，並將病毒DNA與人體DNA整合。很多科學家都曾嘗試破解這種與病毒DNA綁定的整合酶的三維結構，結果都無功而返。新的抗逆轉錄酶病毒藥物很多是利用抑制整合酶的功能來達到治療艾滋病的目的，但科學家們並沒有確切了解這些藥物發揮作用的機制以及增進藥效的機理。

由於只有通過獲取質量較多的晶體才能確定整合酶的結構，在此次研究中，帝國理工學院和哈佛大學的研究人員聯手，從一種被稱為原型泡沫病毒(PFV)的逆轉錄病毒中“借”來了整合酶，並用其來製造晶體。雖然目前科學界對原型泡沫病毒所知不多，但基於已有認識，研究人員相信，這種版本的整合酶與艾滋病病毒中的整合酶在結構和功能上非常相似。

研究人員在4年中進行了4萬多次試驗，最終獲得了7種晶體，而其中只有一種晶體的質量足夠多，使得他們可以確定整合酶的三維結構。利用鑽石光源中心的大型同步加速器，研究人員採集了晶體的X射線衍射數據，從而將結構進行測定。並於隨後首次觀察到這些抗逆轉錄酶病毒藥物如何與整合酶結合併阻斷其活性。

這項研究顯示，艾滋病病毒中整合酶具有完全不同於之前所預期的結構，其破解意味著科學家自此可以充分了解相關藥物的作用原理，以期提高療效並防止艾滋病病毒產生抗藥性。

抑製劑的設計原理和作用機制

據《每日郵報》2010年2月2日報道，科學家們日前成功克服了一項困擾艾滋病病毒研究長達20多年的關鍵性難題，他們的發現將有望研製出一種革命性的抗艾滋病毒新葯，幫助患者獲得更好的治療。

英國和美國的研究人員表示，他們培養了一種晶體能夠清晰看到整合酶的三維結構。這種酶存在於艾滋病毒等逆轉錄酶病毒中，是目前研發抗癌病病毒新藥物的靶標。該項研究報告昨天已公布在權威的《自然》雜誌上。

研究人員在進行了4萬多次試驗后，才獲得了高品質的晶體，通過其可以十分清晰地看到整合酶的三維結構。倫敦帝國學院的研究員彼得·切列帕諾夫稱：“雖然最初進展極為緩慢，經歷了許多次失敗，但我們沒有放棄，並最終獲得了成功。”

來自倫敦帝國學院及哈佛大學的科學家稱，掌握整合酶的三維結構后，可以幫助人們充分了解整合酶如何抑製藥物發揮作用，如何對藥物進行改良，以及如何阻止艾滋病病毒對藥物產生抗體等問題。

目前，全球範圍內已有近6000萬人感染艾滋病病毒，而且自艾滋病病毒開始傳播以來，已有2500萬人死於該病毒之手。儘管雞尾酒療法能夠維持被感染病人的健康，但卻無法治癒並進行預防。