SD序列

在起始密碼子上游約4～7個核苷酸之前還有一段富含嘌吟的5′…AGGAGG…3′短小序列，它可以與16SrRNA3′端的3′…UCCUCC…5′區段完全互補。mRNA上的這段序列稱為ShineDalgarno序列（簡稱SD序列）。

SD序列與16SrRNA序列互補的程度以及從起始密碼子AUG到嘌呤片段的距離也都強烈地影響翻譯起始的效率。不同基因的mRNA有不同的SD序列，它們與16SrRNA的結合能力也不同，從而控制著單位時間內翻譯過程中起始複合物形成的數目，最終控制著翻譯的速度。

SD序列（Shine-Dalgarnosequence）：mRNA中用於結合原核生物核糖體的序列。儲存在DNA分子中的這種遺傳信息能在複製中產生更多的拷貝，並翻譯成蛋白質。DNA的功能構成了信息的流動，遺傳信息如何轉變成蛋白質呢？轉錄就是其中的重要的一環。基因表達時以DNA的一條鏈為模板合成RNA，這一過程就是轉錄（transcription）。催化合成RNA的酶叫做RNA聚合酶（RNApolymerase）。RNA和DNA結構相似，所不同之處在於：（1）RNA一般以單鏈形式存在；（2）RNA中的核糖其C′-2不脫氧的；（3）尿苷（U）取代了DNA中的胸苷。細胞中的RNA分成三種：mRNA（信使RNA），tRNA（轉運RNA）和rRNA（核糖體RNA）。它們的功能各不相同。mRNA是合成蛋白質的模板，tRNA是轉運特異氨基酸的運載工具，rRNA是合成蛋白質的裝置。mRNA的鹼基序列，決定著蛋白質裝配時氨基酸的序列。

1955年Brachet用洋蔥根尖和變形蟲進行了實驗；若加入RNA酶降解細胞中的RNA，則蛋白質合成就停止，若再加入從酵母中提取的RNA，則又可以重新合成一些蛋白質，這就表明，蛋白質的合成是依賴於RNA。

同年Goldstein和Plaut用同位素標記變形蟲（Amoebaproteus）RNA前體，發現標記的RNA都在核內，表明RNA是在核內合成的。在標記追蹤（pulse-chase）實驗中，用短脈衝標記RNA前體，然後將細胞核轉移到未標記的變形蟲中。經過一段時間發現被標記的RNA分子已在細胞質中，這就表明RNA在核中合成，然後轉移到細胞質內，而蛋白質就在細胞質中合成，因此RNA就成為在DNA和蛋白質之間傳遞信息的信使的最佳候選者。

1956年ElliotVolkin和LawrenceAstrachan作了一項很有意思的觀察：當E.coli被T2感染，迅速停止了RNA的合成，但噬菌的RNA卻開始迅速合成。用同位素脈衝一追蹤標記表明噬菌的RNA在很短的時間內就進行合成，但很快又消失了，表明RNA的半衰期是很短的。由於這種新合成的RNA的鹼基比和T2的DNA鹼基比相似，而和細菌的鹼基比不同，所以可以確定新合成的RNA是T2的RNA。由於T2感染細菌時注入的是DNA，而在細胞里合成的是RNA，可見DNA是合成RNA的模板。最令人信服的證據來自DNA-RNA的雜交實驗。Hall.B.D和Spiegeman,S，將T2噬菌體感染E.coli后立即產生的RNA分離出來，分別與T2和E.coli的DNA進行分子雜交，結果發現這種RNA只能和T2的DNA雜交形成“雜種”鏈，而不能和E.coli的DNA進行雜交。表明T2產生的這種RNA（即mRNA）至少和T2的DNA中的一條鏈是互補的。

Brenner,s.Jacob,F.和Meselson（1961）進行了一系列的的實驗，他們將E.coli培養在15N/13C的培養基中，因此合成的RNA和蛋白都被“重”同位素所標記。也就是說凡是“重”的核糖體，RNA和蛋白都是細菌的，然後用T2感染E.coli，細菌的RNA停止合成，而開始合成T2的RNA此時用普通的“輕”培養基（14N/12C），但分別以32P來標記新合成的T2RNA，以35S標記新合成的T2蛋白，因此任何重新合成的核糖體，RNA，及蛋白都是“輕”的但帶但有放射性同位素。經培養一段時間后破碎細胞，加入過量的輕的核糖體作對照，進行密度梯度離心，結果“輕”的核糖體上不具有放射性，“重”的核糖體上具有32P和35S，表明（1）T2未合成核糖體，“輕”核糖體卻是后加放的。（2）T2翻譯時是借用了細菌原來合成的核糖體，所以核糖體並無特異性，核糖體上結合的mRNA，其序列的特異性才是指導合成蛋白質的遺傳信息，從而提出了mRNA作為“信使”的證據。因此他們將這種能把遺傳信息從DNA傳遞到蛋白質上的物質稱為“信使”。他們預言（1）這種“信使”應是一個多核苷酸；（2）②其平均分子量不小於5´105（假定密碼比是3），足以攜帶一個基因的遺傳信息；（3）它們至少是暫時連在核糖體上；（4）其鹼基組成反映了DNA的序列；（5）它們能高速更新。Volkin和Astrachan發現高速更新的RNA似乎完全符合以上條件。Jacob和Monod將它定名為信使RNA（MessengerRNA）或mRNA。

用自洽聚類方法判定大腸桿菌蛋白質編碼基因SD序列強弱，給出構成強SD序列的17種鹼基關聯模式。將全部SD序列按作用強弱不同分為三類：強、中、弱，發現強弱不同時最偏好模式不同，如GGAGG是弱SD序列的最偏好模式，AAGGA是強SD序列的最偏好模式。同一模式距起始密碼子的距離不同時，所起的調控作用也不同，如GGAG模式中的A在強SD序列中位於-8位點，在弱SD序列中位於-7和-9位點。平均來說，各SD序列的-9位點上鹼基G出現的概率最大。結果還表明SD序列越強，基因的表達水平越高，SD序列越弱，基因表達水平越低。SD序列與anti-SD序列的配對程度和相對位置影響起始密碼子的識別和翻譯效率。

KOZAK是一個女科學家，她研究過起始密碼子ATG周邊鹼基定點突變后對轉錄和翻譯所造成的影響，並總結出在真核生物中，起始密碼子兩端序列為：——G/N-C/N-C/N-ANNATGG——，如GCCACCATGG、GCCATGATGG時，轉錄和翻譯效率最高，特別是-3位的A對翻譯效率非常重要。關於kozak序列的這篇文章發表在NucleicAcidsRes.1984上，該序列被後人稱為kozak序列，並被應用於表達載體的構建中。

原核基因轉錄和翻譯幾乎在胞質中同時發生，在mRNA5’端起始密碼子AUG上游-3~-11處，為核蛋白體rRNA的結合位點（3-9bp）因由Shine-Delgarno發現，又稱SD序列。此序列富含A-G，恰與16SRNA3’端富含T-C的序列互補，因此mRNA與核蛋白體sRNA容易配對結合。因此SD序列對mRNA的翻譯起重要作用。

啟動子下游從轉錄起始位點開始延伸的一段鹼基序列，其中能與rRNA16S亞基3'端互補的SD序列對形成翻譯起始複合物是必需的，多數載體啟動子下游都有SD序列，也有些載體沒有，適合自帶SD序列的基因表達。

核糖體不在一個mRNA的末端啟動轉錄過程，相反，它們會結合到一個內部點（Shine-Dalgarno(SD)序列）上，然後單向轉位。對斷開核糖體的mRNA和30S部分之間的結合所需的力進行的精確測量顯示，在第一個肽鏈形成之前，SD序列穩定核糖體-mRNA的相互作用。一旦該肽鏈形成，SD序列就不再穩定它。所以，最初肽鏈的形成是核糖體釋放SD的一個觸發因素，而且還可能是允許核糖體開始沿mRNA運動的一個重要因素。

反義RNA(antisenseRNA)是指mRNA互補的RNA分子。這種反義RNA能與mRNA分子特異性地互補結合，從而抑制該mRNA的加工與翻譯，是原核細胞中基因表達的調控的一種方式。然而，許多實驗證明，在真核細胞中亦存在反義RNA，但其功能尚未全部明了。最近幾年來通過人工合成反義RNA的基因，並將之導入細胞內，轉錄出反義RNA，即能抑制特定基因的表達，阻斷該基因的功能，有助於了解該基因對細胞生長和分化的作用。同時也暗示了該方法對腫瘤實施基因治療的可能性。

Ⅰ類：這類反義RNA直接作用於其靶mRNA的SD序列和/或編碼區，引起翻譯的直接抑制(ⅠA類)或與靶mRNA結合后引起該雙鏈RNA分子對RNA酶Ⅲ的敏感性增加，使其降解(ⅠB類)。Ⅱ類：這類反義RNA與mRNA的SD序列的上游非編碼區結合，從而抑制靶mRNA的翻譯功能。其作用機制尚不完全清楚，可能是反義RNA與靶mRNA的上游序列結合後會引起核糖體結合位點區域的二級結構發生改變，因而阻止了核糖體的結合。Ⅲ類：這類反義RNA可直接抑制靶mRNA的轉錄。

ticRNA(transcriptioninhibitorycomplementaryRNA)是大腸桿菌中CAP蛋白(cAMP結合蛋白)的mRNA的反義RNA。ticRNA的基因的啟動子可被cAMP-CAP複合物所激活，從CAPmRNA的轉錄起始位點上游3個核苷酸處開始，以CAPmRNA的模板DNA鏈的互補鏈為模板，合成ticRNA。ticRNA具體長度不清楚，但是它是5'端一段正好和CAPmRNA的5'端有不完全的互補，可以形成雙鏈的RNA雜交體。而在CAPmRNA上緊隨雜交區之後的是一段約長11bp的A，U豐富區。這樣的結構十分類似於ρ不依賴性的轉錄終止子的結構，從而CAPmRNA的轉錄剛剛開始不久后即迅速終止。CAP蛋白合成的自我調節作用。當CAP合成達一定量后，即可與cAMP結合成cAMP-CAP複合物。再激活ticRNA的啟動子轉錄出ticRNA，反過來抑制CAP-mRNA的合成。

1、長的反義RNA並不一定比短的反義RNA更為有效。

2、在原核生物中針對SD序列及其附近區域的反義RNA可能更有效。

3、在真核生物中，對應於5'端非編碼區的反義RNA可能比針對編碼區的反義RNA更有效。

4、盡量避免在反義RNA分子中出現自我互補的二級結構。

5、設計的反義RNA分子中不應有AUG或開放讀框，否則該反義RNA亦會與核糖體結合而影響其與靶mRNA的配對結合。

6、進一步還可以將帶有ribozyme結構的RNA連在反義RNA的3'端尾上，當反義RNA與靶mRNA雜交后，即可利用其酶活性來降解靶mRNA。

此外，為了增強反義RNA的作用，還可以採取一些額外措施，例如：

1、由於反義RNA對靶mRNA的抑制作用有劑量依賴性，所以在構建反義RNA基因時，要選擇強的、可以誘導的啟動子以增強反義RNA本身的表達。

2、構建許多個反義RNA基因串連在一起，以得到線性重複的多拷貝基因，對提高反義RNA的表達也有利。

3、RNA酶Ⅲ可以降解RNA:RNA雜交體，所以在構建反義RNA基因時，可將RNA酶Ⅲ的基因也同時轉化到靶細胞中並進行表達。這樣，當反義RNA與靶mRNA結合后，RNA酶Ⅲ即可將其降解。這顯然有利於反義RNA的抑制作用。

有關反義RNA的研究進展迅速，已經應用到抗病毒感染，研究癌基因的作用機制，探索腫瘤治療的可行途徑等方面。在今後一段時間內，有關反義RNA的研究肯定將會有更加迅速的進展和更廣闊的應用前景。