SD序列

SD序列

SD序列在細菌mRNA起始密碼子AUG上游10個鹼基左右處,有一段富含嘌呤鹼基序列,能與細菌16SrRNA3’端識別,幫助從起始AUG處開始翻譯。在細菌mRNA起始密碼子AUG上游10個鹼基左右處,有一段富含嘌呤的鹼基序列,能與細菌16SrRNA3’端識別,幫助從起始AUG處開始翻譯。在原核生物中,核糖體中與mRNA結合位點位於16SrRNA的3端,mRNA中與核糖體16SrRNA結合的序列稱為SD序列(SDsequence),它是1974年由J.Shine和L.Dalgarno發現的,故此而命名。SD序列是mRNA中5'端富含嘌呤的短核苷酸序列,一般位於mRNA的起始密碼AUG的上游5~10個鹼基處,並且同16SrRNA3'端的序列互補。

特徵


在起始密碼子上游約4~7個核苷酸之前還有一段富含嘌吟的5′…AGGAGG…3′短小序列,它可以與16SrRNA3′端的3′…UCCUCC…5′區段完全互補。mRNA上的這段序列稱為ShineDalgarno序列(簡稱SD序列)。
SD序列與16SrRNA序列互補的程度以及從起始密碼子AUG到嘌呤片段的距離也都強烈地影響翻譯起始的效率。不同基因的mRNA有不同的SD序列,它們與16SrRNA的結合能力也不同,從而控制著單位時間內翻譯過程中起始複合物形成的數目,最終控制著翻譯的速度。

來源


SD序列(Shine-Dalgarnosequence):mRNA中用於結合原核生物核糖體的序列。儲存在DNA分子中的這種遺傳信息能在複製中產生更多的拷貝,並翻譯成蛋白質。DNA的功能構成了信息的流動,遺傳信息如何轉變成蛋白質呢?轉錄就是其中的重要的一環。基因表達時以DNA的一條鏈為模板合成RNA,這一過程就是轉錄(transcription)。催化合成RNA的酶叫做RNA聚合酶(RNApolymerase)。RNA和DNA結構相似,所不同之處在於:(1)RNA一般以單鏈形式存在;(2)RNA中的核糖其C′-2不脫氧的;(3)尿苷(U)取代了DNA中的胸苷。細胞中的RNA分成三種:mRNA(信使RNA),tRNA(轉運RNA)和rRNA(核糖體RNA)。它們的功能各不相同。mRNA是合成蛋白質的模板,tRNA是轉運特異氨基酸的運載工具,rRNA是合成蛋白質的裝置。mRNA的鹼基序列,決定著蛋白質裝配時氨基酸的序列。
1955年Brachet用洋蔥根尖和變形蟲進行了實驗;若加入RNA酶降解細胞中的RNA,則蛋白質合成就停止,若再加入從酵母中提取的RNA,則又可以重新合成一些蛋白質,這就表明,蛋白質的合成是依賴於RNA。
同年Goldstein和Plaut用同位素標記變形蟲(Amoebaproteus)RNA前體,發現標記的RNA都在核內,表明RNA是在核內合成的。在標記追蹤(pulse-chase)實驗中,用短脈衝標記RNA前體,然後將細胞核轉移到未標記的變形蟲中。經過一段時間發現被標記的RNA分子已在細胞質中,這就表明RNA在核中合成,然後轉移到細胞質內,而蛋白質就在細胞質中合成,因此RNA就成為在DNA和蛋白質之間傳遞信息的信使的最佳候選者。
SD序列
SD序列
1956年ElliotVolkin和LawrenceAstrachan作了一項很有意思的觀察:當E.coli被T2感染,迅速停止了RNA的合成,但噬菌的RNA卻開始迅速合成。用同位素脈衝一追蹤標記表明噬菌的RNA在很短的時間內就進行合成,但很快又消失了,表明RNA的半衰期是很短的。由於這種新合成的RNA的鹼基比和T2的DNA鹼基比相似,而和細菌的鹼基比不同,所以可以確定新合成的RNA是T2的RNA。由於T2感染細菌時注入的是DNA,而在細胞里合成的是RNA,可見DNA是合成RNA的模板。最令人信服的證據來自DNA-RNA的雜交實驗。Hall.B.D和Spiegeman,S,將T2噬菌體感染E.coli后立即產生的RNA分離出來,分別與T2和E.coli的DNA進行分子雜交,結果發現這種RNA只能和T2的DNA雜交形成“雜種”鏈,而不能和E.coli的DNA進行雜交。表明T2產生的這種RNA(即mRNA)至少和T2的DNA中的一條鏈是互補的。
Brenner,s.Jacob,F.和Meselson(1961)進行了一系列的的實驗,他們將E.coli培養在15N/13C的培養基中,因此合成的RNA和蛋白都被“重”同位素所標記。也就是說凡是“重”的核糖體,RNA和蛋白都是細菌的,然後用T2感染E.coli,細菌的RNA停止合成,而開始合成T2的RNA此時用普通的“輕”培養基(14N/12C),但分別以32P來標記新合成的T2RNA,以35S標記新合成的T2蛋白,因此任何重新合成的核糖體,RNA,及蛋白都是“輕”的但帶但有放射性同位素。經培養一段時間后破碎細胞,加入過量的輕的核糖體作對照,進行密度梯度離心,結果“輕”的核糖體上不具有放射性,“重”的核糖體上具有32P和35S,表明(1)T2未合成核糖體,“輕”核糖體卻是后加放的。(2)T2翻譯時是借用了細菌原來合成的核糖體,所以核糖體並無特異性,核糖體上結合的mRNA,其序列的特異性才是指導合成蛋白質的遺傳信息,從而提出了mRNA作為“信使”的證據。因此他們將這種能把遺傳信息從DNA傳遞到蛋白質上的物質稱為“信使”。他們預言(1)這種“信使”應是一個多核苷酸;(2)②其平均分子量不小於5´105(假定密碼比是3),足以攜帶一個基因的遺傳信息;(3)它們至少是暫時連在核糖體上;(4)其鹼基組成反映了DNA的序列;(5)它們能高速更新。Volkin和Astrachan發現高速更新的RNA似乎完全符合以上條件。Jacob和Monod將它定名為信使RNA(MessengerRNA)或mRNA。

判斷方法


用自洽聚類方法判定大腸桿菌蛋白質編碼基因SD序列強弱,給出構成強SD序列的17種鹼基關聯模式。將全部SD序列按作用強弱不同分為三類:強、中、弱,發現強弱不同時最偏好模式不同,如GGAGG是弱SD序列的最偏好模式,AAGGA是強SD序列的最偏好模式。同一模式距起始密碼子的距離不同時,所起的調控作用也不同,如GGAG模式中的A在強SD序列中位於-8位點,在弱SD序列中位於-7和-9位點。平均來說,各SD序列的-9位點上鹼基G出現的概率最大。結果還表明SD序列越強,基因的表達水平越高,SD序列越弱,基因表達水平越低。SD序列與anti-SD序列的配對程度和相對位置影響起始密碼子的識別和翻譯效率。

作用


SD序列
SD序列
KOZAK是一個女科學家,她研究過起始密碼子ATG周邊鹼基定點突變后對轉錄和翻譯所造成的影響,並總結出在真核生物中,起始密碼子兩端序列為:——G/N-C/N-C/N-ANNATGG——,如GCCACCATGG、GCCATGATGG時,轉錄和翻譯效率最高,特別是-3位的A對翻譯效率非常重要。關於kozak序列的這篇文章發表在NucleicAcidsRes.1984上,該序列被後人稱為kozak序列,並被應用於表達載體的構建中。
原核基因轉錄和翻譯幾乎在胞質中同時發生,在mRNA5’端起始密碼子AUG上游-3~-11處,為核蛋白體rRNA的結合位點(3-9bp)因由Shine-Delgarno發現,又稱SD序列。此序列富含A-G,恰與16SRNA3’端富含T-C的序列互補,因此mRNA與核蛋白體sRNA容易配對結合。因此SD序列對mRNA的翻譯起重要作用。

肽鏈的形成


啟動子下游從轉錄起始位點開始延伸的一段鹼基序列,其中能與rRNA16S亞基3'端互補的SD序列對形成翻譯起始複合物是必需的,多數載體啟動子下游都有SD序列,也有些載體沒有,適合自帶SD序列的基因表達。
核糖體不在一個mRNA的末端啟動轉錄過程,相反,它們會結合到一個內部點(Shine-Dalgarno(SD)序列)上,然後單向轉位。對斷開核糖體的mRNA和30S部分之間的結合所需的力進行的精確測量顯示,在第一個肽鏈形成之前,SD序列穩定核糖體-mRNA的相互作用。一旦該肽鏈形成,SD序列就不再穩定它。所以,最初肽鏈的形成是核糖體釋放SD的一個觸發因素,而且還可能是允許核糖體開始沿mRNA運動的一個重要因素。

RNA的生物合成


SD序列
SD序列
反義RNA(antisenseRNA)是指mRNA互補的RNA分子。這種反義RNA能與mRNA分子特異性地互補結合,從而抑制該mRNA的加工與翻譯,是原核細胞中基因表達的調控的一種方式。然而,許多實驗證明,在真核細胞中亦存在反義RNA,但其功能尚未全部明了。最近幾年來通過人工合成反義RNA的基因,並將之導入細胞內,轉錄出反義RNA,即能抑制特定基因的表達,阻斷該基因的功能,有助於了解該基因對細胞生長和分化的作用。同時也暗示了該方法對腫瘤實施基因治療的可能性。
Ⅰ類:這類反義RNA直接作用於其靶mRNA的SD序列和/或編碼區,引起翻譯的直接抑制(ⅠA類)或與靶mRNA結合后引起該雙鏈RNA分子對RNA酶Ⅲ的敏感性增加,使其降解(ⅠB類)。Ⅱ類:這類反義RNA與mRNA的SD序列的上游非編碼區結合,從而抑制靶mRNA的翻譯功能。其作用機制尚不完全清楚,可能是反義RNA與靶mRNA的上游序列結合後會引起核糖體結合位點區域的二級結構發生改變,因而阻止了核糖體的結合。Ⅲ類:這類反義RNA可直接抑制靶mRNA的轉錄。
ticRNA(transcriptioninhibitorycomplementaryRNA)是大腸桿菌中CAP蛋白(cAMP結合蛋白)的mRNA的反義RNA。ticRNA的基因的啟動子可被cAMP-CAP複合物所激活,從CAPmRNA的轉錄起始位點上游3個核苷酸處開始,以CAPmRNA的模板DNA鏈的互補鏈為模板,合成ticRNA。ticRNA具體長度不清楚,但是它是5'端一段正好和CAPmRNA的5'端有不完全的互補,可以形成雙鏈的RNA雜交體。而在CAPmRNA上緊隨雜交區之後的是一段約長11bp的A,U豐富區。這樣的結構十分類似於ρ不依賴性的轉錄終止子的結構,從而CAPmRNA的轉錄剛剛開始不久后即迅速終止。CAP蛋白合成的自我調節作用。當CAP合成達一定量后,即可與cAMP結合成cAMP-CAP複合物。再激活ticRNA的啟動子轉錄出ticRNA,反過來抑制CAP-mRNA的合成。

注意事項


1、長的反義RNA並不一定比短的反義RNA更為有效。
2、在原核生物中針對SD序列及其附近區域的反義RNA可能更有效。
3、在真核生物中,對應於5'端非編碼區的反義RNA可能比針對編碼區的反義RNA更有效。
4、盡量避免在反義RNA分子中出現自我互補的二級結構。
5、設計的反義RNA分子中不應有AUG或開放讀框,否則該反義RNA亦會與核糖體結合而影響其與靶mRNA的配對結合。
6、進一步還可以將帶有ribozyme結構的RNA連在反義RNA的3'端尾上,當反義RNA與靶mRNA雜交后,即可利用其酶活性來降解靶mRNA。
此外,為了增強反義RNA的作用,還可以採取一些額外措施,例如:
1、由於反義RNA對靶mRNA的抑制作用有劑量依賴性,所以在構建反義RNA基因時,要選擇強的、可以誘導的啟動子以增強反義RNA本身的表達。
2、構建許多個反義RNA基因串連在一起,以得到線性重複的多拷貝基因,對提高反義RNA的表達也有利。
3、RNA酶Ⅲ可以降解RNA:RNA雜交體,所以在構建反義RNA基因時,可將RNA酶Ⅲ的基因也同時轉化到靶細胞中並進行表達。這樣,當反義RNA與靶mRNA結合后,RNA酶Ⅲ即可將其降解。這顯然有利於反義RNA的抑制作用。
有關反義RNA的研究進展迅速,已經應用到抗病毒感染,研究癌基因的作用機制,探索腫瘤治療的可行途徑等方面。在今後一段時間內,有關反義RNA的研究肯定將會有更加迅速的進展和更廣闊的應用前景。