雙向電泳

目前，隨著技術的飛速發展，已能分離出10 000個斑點（spot). 當雙向電泳斑點的全面分析成為現實的時候，蛋白質組的分析變得可行.

樣品製備（sample prepareation)和溶解同樣事關2-DE的成效，目標是儘可能擴大其溶解度和解聚，以提高解析度. 用化學法和機械裂解法破碎以儘可能溶解和解聚蛋白，兩者聯合有協同作用. 對IEF(isoelectric focusing）樣品的預處理涉及溶解、變性和還原來完全破壞蛋白間的相互作用，併除去如核酸等非蛋白物質. 理想的狀態是人們應一步完成蛋白的完全處理. 而離液劑2 mol/L硫脲和表面活性劑4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白從IPG(immobilized pH gradients）膠上的轉換.三丁基膦（Tributyl phosphine，TBP）取代β-巰基乙醇或DTT完全溶解鏈間或鏈內的二硫鍵，增強了蛋白的溶解度，並導致轉至第二向的增加]. 兩者通過不同的方法來增加蛋白的溶解度，作為互補試劑會更有效. 在保持樣品的完整性的前提下，可利用超離和核酸內切酶去除核酸（DNA). 除此之外，機械力被用來對蛋白分子解聚，如超聲破碎]等. 另外，添加PMSF等蛋白酶抑製劑，可保持蛋白完整性. 由於商品化的IPG膠條是乾燥脫水的，可在其水化的過程中加樣，覆蓋整個IPG膠，避免在樣品杯中的沉澱所致的樣品丟失]. 此外，低丰度蛋白（low abundance protein）在細胞內可能具有重要的調節功能，代表蛋白質組研究的“冰山之尖”，故分離低丰度蛋白是一種挑戰.亞細胞分級和蛋白質預分級、提高加樣量（已達到1～15 mg級的標準）、應用敏感性檢測，可以提高其敏感性. 如一種多肽免疫2-DE印跡（MI-2DE）是利用幾種單克隆抗體技術來分析和檢測. 提高組蛋白和核糖體蛋白等鹼性蛋白（basic proteins）的分離是另一難點. 由於鹼性pH範圍內凝膠基質的不穩定及逆向電滲流（EOF）的產生，對PI（等電點）超過10的鹼性蛋白，通過產生?0～10%?的山梨醇梯度和16%的異丙醇可減少之. 亦可用雙甲基丙烯醯胺來增加基質的穩定性.

2-DE面臨的挑戰是高解析度和重複性. 高解析度確保蛋白最大程度的分離，高重複性允許進行凝膠間配比（match). 對2-DE而言，有3種方法分離蛋白：1）ISO-DALT(isoelectric focus）以O’Farrell’s技術為基礎. 第一嚮應用載體兩性電解質（carrier ampholyte,CA），在管膠內建立pH梯度. 隨著聚焦時間的延長，pH梯度不穩，易產生陽極漂移. 2） NEPHGE(non-equilibrium pH gradient electrophoresis）用於分離鹼性蛋白（pH>7.0). 如果聚焦達到平衡狀態，鹼性蛋白會離開凝膠基質而丟失. 因此，在等電區域的遷移須在平衡狀態之前完成，但很難控制. 3）IPG-DALT發展於80年代早期. 由於固相pH梯度（Immobilized pH gradient,IPG）的出現解決了pH梯度不穩的問題. IPG通過immobiline共價偶聯於丙烯醯胺產生固定的pH梯度，克服了IEF的缺點，從而達到高度的重複性. 目前可以精確製作線性、漸進性和S型曲線，範圍或寬或窄的pH梯度. 新的酸性pH 3～5或鹼性pH 6～11的IPG凝膠梯度聯合商品化的pH 4～7的梯度可對蛋白質形成蛋白質組重疊群（proteomic contigs）從而有效分離.

分離后的斑點檢測（spot detection）亦很重要. 所採用的檢測策略和分離后所採用的方法的相互作用是很重要的. 此外，還需考慮反應的線性、飽和閾/動態範圍、敏感性、對細胞蛋白群的全體定量分析的適應性、可行性. 目前，沒有一種蛋白染色覆蓋廣泛的濃度和PI及分離後分析技術。銀染已成為一種檢測2-DE的流行方法，可檢測少到2～5ng的蛋白，因此較考馬斯亮藍R-250敏感. 多數糖蛋白不能被考馬斯亮藍染色，一些有機染料不適於PVDF膜。放射性標記不依賴其代謝的活性，並僅適於對合成的蛋白質檢測. 另有一種改良的2-DE（差異凝膠電泳），即應用兩種不同的染料熒游標記兩個樣品，使在同一凝膠上電泳后的凝膠圖象為兩個，避免了幾種2-DE的比較，可在納克級進行檢測.

較早期相比，2-DE有兩個主要的進步：首先，極高的重複性使有機體的參考圖譜，可通過Internet獲得，來比較不同組織類型、不同狀態的基因表達；其次，高加樣量使得2-DE成為一項真正的製備型技術.

重泡脹后的膠可以不用轉移到另一個電泳槽，直接跑 2D 的一向嗎？

一般情況下是可以的。但當上樣量特別大時，可能會有一部分蛋白質沒有被膠條吸收，這樣跑完 1D 和 2D 膠后，會有很多橫向條紋。所以在這種情況下，最好在重泡脹后，將膠條轉移到另外一個電泳漕中進行電泳。

為什麼我在等電聚焦前加的礦物油在聚焦後會減少，暴露出了膠條的背面？

通常情況下，等點聚焦中體系內除了蛋白質還會存在少量帶電小分子，當這些帶電小分子在電場中向兩極運動時，會帶動膠條中的水分子運動，水分子運動會帶動附近的覆蓋油移動，當樣品質量不高，帶電小分子較多時，會導致覆蓋油移動嚴重溢出膠條槽，此時，通常會伴隨膠條的酸性端膠條厚度增加。當發生覆蓋油溢出或膠條暴露時，應及時補加覆蓋油。為了防止這個現象的發生，應從樣品製備時嚴格控制樣品質量，盡量減少帶電小分子如鹽離子的含量。同時可以在相鄰的空電泳槽里，也加入適量（80 %滿）的覆蓋油。

跑第一向時，為什麼要設定一個電流的最大值電壓（50 μ A/ 膠）？

電流的平方和功率成正比。電流增大，功率增大，放出的熱量也隨之增大，就會導致膠條的溫度增加。當溫度超過 30 攝氏度時，緩衝液里的尿素就容易解離，產生一些極性分子，修飾蛋白，從而對等電聚焦產生影響。

跑第一向時，為什麼剛開始的電壓比較低，而後逐漸增高？

剛開始時，體系內的帶電小分子比較多（比如無機鹽和雙極性分子）。所以在這個階段，電流主要是由這些小分子的移動所產生的。由於這些分子質量小，移動他們不需要很高的電壓。當這些小分子移動到他們的目的地時（無機鹽移動到極性相反的電極；兩性分子移動到對應的 pH 條帶），體系內的蛋白質才開始肩負起運載電流的任務，逐漸向所對應的 pH 區域移動，而蛋白質運動需要較高的電壓。

跑第一向時，為什麼會產生一條藍色的條帶，並逐漸向酸性端移動？

藍色條帶是緩衝液中痕量的溴酚藍被聚焦所產生的。溴酚藍也是 pH 指示劑，當它移動到酸性區時（pH4），顏色會變成黃色。溴酚藍的這個移動過程大體上發生在極性小分子的聚焦之後，蛋白質大分子聚焦之前。

跑第一向時，為什麼電壓總達不到預定值？

當上樣量比較大時或體系內鹽分比較多時，聚焦的電壓有可能達不到所設定的數值。

跑第一向時，在電壓達到預定值后，電流為什麼會降低？

當上樣量比較少時，所有蛋白在較短的時間內就移動到所對應的 pH 值區域值，從而變成中性分子。這樣，體系的電阻越來越大，在恆定的電壓下，電流就會越來越小。

跑第一向時，為什麼在兩個電極絲附近有氣泡產生？

等電聚焦完成後，所有的蛋白質都移動到了相應的 pI 值區域，而成為中性分子。這時加在體繫上的電壓就開始電解水分子，在陽極產生氧氣，在陰極產生氫氣。

重泡脹緩衝液（rehydration buffer）中的硫脲的作用是什麼，雙極性分子的作用是什麼？

硫脲的作用是增加蛋白質的溶解性，特別是鹼性蛋白的溶解性。雙極性分子的作用也是增加蛋白質的溶解性。當蛋白移動到相應的 pH 值后，就變成了中性分子。而不帶電荷的蛋白質分子容易聚集，從而降低其在隨後的二向膠時的遷移效率，可能會造成豎的脫尾。而硫脲和雙極性小分子則會鑒定中性蛋白質之間的相互作用，防止它們的聚集。

怎樣估計 2D 膠上蛋白質點的分子量和 pI 值？

可以根據膠條的pH範圍和長度估算蛋白質點的pI值，在第二向中加入分子量Marker估算蛋白質點分子量。也可以用體系內已知蛋白來做比對。

為什麼 2D 膠上的蛋白點有橫的和豎的脫尾？

橫的脫尾可能是：1）一向等電聚焦不完全； 2）某些蛋白質本身的原因（糖蛋白）； 3）蛋白的丰度太高。豎的脫尾可能是1）平衡時碘乙醯胺量不足；2）跑二向時，蛋白的溶解度不好。

什麼成分會影響 2D 膠的效果？

核酸，鹽，去垢劑等等。

2D 膠的上樣量應該在什麼範圍？

上樣量和樣品有關。樣品內蛋白種類多的上樣量要大些，這樣每個點才有足夠的量被檢測到。一般的全細胞裂解體系，上樣量大概在 100 微克（銀染）到 500 微克（考染）之間。

我的蛋白質濃度很低，應該用什麼方法來濃縮？

蛋白質的濃縮有很多方法。大致有超濾法，沉澱法和透析法。超濾比較溫和，對蛋白質不會有修飾和改變，蛋白的種類一般不會有丟失。它的缺點是總樣品的量可能會減少（被膜所吸附）。另外超濾對樣品的要求比較高。甘油，去垢劑都會堵塞濾膜，影響超濾的效果。沉澱法比較快速，容易操作，對鹽，甘油，去垢劑的耐受性好。缺點是可能會有部分種類的蛋白沒有被沉澱下來（丟失）。沉澱法中，又以 TCA 法最為普遍使用。使用 TCA 法時，一定要用冷的純丙酮清洗蛋白沉澱兩次，去處殘留的 TCA 和其他沉澱下來的雜質。透析法只使用於量比較大的樣品，量小時，操作困難。透析法可以和超濾法聯用。先把樣品透析到一個比較乾淨的環境（不含鹽，甘油，去垢劑或其它雜質，比如碳酸氫氨溶液），然後再進行超濾。

第一向等電聚焦

⒈ 從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩衝液（I）（不含DTT，不含IPG buffer）一小管（1ml/管），置室溫溶解。

⒉ 在小管中加入0.01g DTT， 0.5% 對應膠條pH範圍的IPG buffer，充分混勻。

⒊ 從小管中取出400微升水化上樣緩衝液，加入100微升樣品（考馬斯亮藍染色需樣品1mg，銀染需300μg），充分混勻。

⒋ 從冰箱中取-20℃冷凍保存的IPG預製膠條，室溫中放置10分鐘。

⒌ 沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質的分佈。

⒍ 當所有的蛋白質樣品都已經加入到聚焦盤或水化盤中后，用鑷子輕輕的去除預製IPG膠條上的保護層。

⒎ 分清膠條的正負極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置於聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極（標有+）對應於聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因為這些溶液不會被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產生氣泡。如果已經產生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。

⒏ 在每根膠條上覆蓋1-3ml礦物油，防止膠條水化過程中液體的蒸發。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。

⒐ 對好正、負極，蓋上蓋子。設置等電聚焦程序。

⒑聚焦結束的膠條。立即進行平衡、第二向SDS-PAGE電泳，否則將膠條置於樣品水化盤中，-20℃冰箱保存。

第二向SDS-PAGE電泳

⒈ 裝配灌膠模具，配製10%的丙烯醯胺凝膠兩塊。配200ml凝膠溶液，每塊凝膠50ml，將溶液沿灌膠模具背面槽道倒入，直至溶液到距離玻璃板1cm停止，用75%乙醇或水飽和正丁醇封面，保持膠面平整。聚合30分鐘后，凝膠與上方液體分層，表明凝膠已基本聚合，建議聚合3-5h使凝膠完全聚合。

⒉ 待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇，用MilliQ水沖洗。

⒊ 從-20℃冰箱中取出的膠條，先於室溫放置10分鐘，使其恢復至室溫。

⒋ 配製膠條平衡緩衝液I（含DTT）。

5．在桌上先放置乾的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在乾的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕，擠去多餘水分，然後直接置於膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多餘樣品。這可以減少凝膠染色時出現的縱條紋。

⒍ 將膠條轉移至平衡管或溶脹盤中，每個槽一根膠條，在有膠條的槽中加入5-10ml膠條平衡緩衝液I。將平衡管或溶脹盤放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。

⒎ 配製膠條平衡緩衝液Ⅱ（含碘乙醯胺）。

⒏ 第一次平衡結束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩衝液I。並用濾紙吸取多餘的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。再加入膠條平衡緩衝液Ⅱ，繼續在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。

⒐ 用濾紙吸去SDS-PAGE聚丙烯醯胺凝膠上方玻璃板間多餘的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上，長玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的頂部對著自己。

⒑將低熔點瓊脂糖封膠液進行加熱溶解。

⒒將10×電泳緩衝液，用量筒稀釋10倍，成1×電泳緩衝液。趕去緩衝液表面的氣泡。

⒓第二次平衡結束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩衝液Ⅱ。並用濾紙吸取多餘的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。

⒔將IPG膠條從樣品水化盤中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1×電泳緩衝液中。然後將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上。其餘膠條同樣操作。

⒕將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉移到灌膠架上，短玻璃板一面對著自己。在凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封膠液。

⒖用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯醯胺凝膠膠面完全接觸。注意不要在膠條下方產生任何氣泡。在用鑷子、壓舌板或平頭針頭推膠條時，要注意是推動凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。

⒗放置5分鐘，使低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固。

⒘在低熔點瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠轉移至電泳槽中。

⒙在電泳槽加入電泳緩衝液后，接通電源，起始時用的低功率（1W/gel/18-24cm）或低電壓，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流（或電壓）（13-15W/gel/18-24cm），待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳。

⒚電泳結束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，並切角以作記號（戴手套，防止污染膠面）。

⒛進行染色。

1、樣品新鮮。

說明：組織樣本及細胞採樣后應立即放入液氮中速凍或加入樣品穩定劑，運輸過程中血液、血清樣品4℃保存，其它樣品-20℃保存，不超過48小時（若外地郵寄，除血液、血清及細胞外請用乾冰）。

2、樣品蛋白的總量不少於1mg。

說明：組織樣本每份約250-500mg；

細胞樣品每份106—107細胞數（一塊膠）；

血液、血清等樣品大於5mL，且不能溶血；

蛋白提取物要求蛋白濃度大於5mg/mL，總量不少於1mg，且均勻無沉澱，樣品中無鹽成分；

植物或真菌樣品量濕重不少於2g；

富含雜質或蛋白質含量低的樣品量濕重不少於3g 。