泛素

基本信息

泛素（ubiquitin）是一類真核細胞內廣泛存在的小分子蛋白質，大小為76個氨基酸殘基。泛素間可以通過酶促反應相互連接，進而介導靶蛋白降解。

化學反應

催化的一系列反應的發生，整個過程被稱為泛素化信號通路。在第一步反應中，泛素激活酶（又被稱為E1）水解ATP並將一個泛素分子腺苷酸化。接著，泛素被轉移到E1的活性中心的半胱氨酸殘基上，並伴隨著第二個泛素分子的腺苷酸化。被腺苷酸化的泛素分子接著被轉移到第二個酶，泛素結合酶（E2）的半胱氨酸殘基上。最後，高度保守的泛素連接酶（E3）家族中的一員（根據底物蛋白質的不同而不同）識別特定的需要被泛素化的靶蛋白，並催化泛素分子從E2上轉移到靶蛋白上。通常認為，靶蛋白在被26S蛋白酶體識別之前，必須被標記上至少四個泛素單體形成的K48位或者K11位連接的多聚泛素鏈，但最新也有研究表明兩個泛素單體形成的泛素鏈更能有效地被蛋白酶體降解。一般而言，是E3使得這一系統具有了底物特異性，而E2或者E2-E3決定底物上泛素鏈的類型。E1、E2和E3蛋白的數量依賴於生物體和細胞類型，人體中就存在大量不同的E3蛋白，這說明泛素-蛋白酶體系統可以作用於數量巨大的靶蛋白。

多泛素化后的蛋白質是如何被蛋白酶體所識別的，還沒有完全弄清。泛素受體蛋白的N末端具有一個類泛素結構域，以及一至多個泛素結合結構域。類泛素結構域可以被19S調節顆粒所識別，而泛素結合結構域可以通過形成三螺旋束來結合泛素。這些受體蛋白可能能夠結合多泛素化的蛋白質並將其攜帶到蛋白酶體，而關於這種結合的特異性和調控機制還不清楚。最終，被標記的蛋白質被蛋白酶分解為較小的多肽、氨基酸以及可以重複使用的泛素。

2004年，阿龍·切哈諾沃、阿夫拉姆·赫什科、歐文·羅斯因發現了泛素調解的蛋白質降解過程而獲得了諾貝爾化學獎。

田中啟二，1976年從德島大學醫學院研究科大學院博士課程中途退學，經過德島大學酶研究所助手，酶科學研究中心助教授，從96年起東京都醫學院研究機構東京都臨床醫學綜合研究所分子腫瘤學研究部門部長，2002年至今任同研究所副所長。

譯者介紹

當初引起我翻譯這篇文章的衝動是因為他寫得很好，使我有一種想好故事大家分享的想法。但凡事說起容易，做起來難，各種專業名詞和本人並不高的日語水平，使得這片並不長的文章的翻譯時間拖了又拖。儘管我盡了最大努力，我仍然無法確定內容的權威性，大家最好僅僅當做一個故事，而對細節的正確與否請放過。

現在回想泛素的發現，不能不提到兩個先驅性的研究。泛素的發現最早要回溯到半個世紀前，1953年，Simpson 利用當時普及的放射性同位素進行代謝實驗，發表了“生物細胞中的蛋白質分解中需要代謝能量即需要ATP的加水分解”的論文。但是，這個劃時代的研究，在以後的很長一段時間裡，被人忽視了。在當時熱力學的世界觀中，加水分解反應是產能反應，與需要能量的合成反應不同，這個過程是不需要能量的。另一個先驅性的研究是Goldberg等的論文（1977），他們報道在試管內再現Simpson所觀察到的現象。這篇論文喚醒了在圖書館底沉睡的Simpson的發現。Goldberg等報道網織紅細胞的提取液中加入ATP顯著促進了蛋白質的分解，也就是伴隨著蛋白分解有能量的消耗。這個發現中，選擇網織紅細胞是獨具慧眼的。Goldberg等注意到網織紅細胞向紅細胞最終分化時候，不再需要的核，細胞器，溶酶體等細胞內的蛋白質在細胞內快速分解，也就是在蛋白質合成活躍的網織紅細胞中，其分解活性也非常高。可以這麼說，這個選擇決定了一切。實際上，如果不是在網織紅細胞的提取液中加入ATP，離體進行Simpson 的實驗觀察，泛素的發現可能還要等上好多年。ATP依賴性的蛋白分解在在體情況的發現，暗示了其生化學的可能機制。

上面的研究和其他關於蛋白質分解的不可思議現象開始吸引人們的目光。1960年代前期，發現了充滿了加水分解酶細胞器--溶酶體，因此其被認為蛋白分解的主要器官。但是溶酶體的非選擇性破壞方式難以說明在細胞器中壽命和表達水平千差萬別的蛋白質個體間的矛盾。不過在當時，這只是少數意見並逐漸銷聲匿跡了。但在70年代，隨著溶酶體機能抑製劑的開發，經過這些試劑處理過的細胞仍然有恆定的蛋白質分解難以抑制，表明了存在與溶酶體不同的蛋白分解系統，基於這些觀察，當時稱之為“非溶酶體的蛋白質分解系統”。沒過多久，這個“非溶酶體的蛋白質分解系統”與前面所提到的“ATP依賴性的蛋白分解系統”便合二為一了。

為了保持溶酶體和細胞器內的酸性pH值，需要代謝能量，但這些能量是來自膜型的ATP泵（ATPase）的作用，與Goldberg等所觀察到的細胞質的能量消耗的機制是完全不同的。實際上，像大腸桿菌這樣的不含細胞器的原核生物的蛋白質分解也是需要代謝能量的，由此明確了ATP依賴性蛋白水解酶系和溶酶體系統是相互獨立存在的。接著，在大腸桿菌內發現了ATP依賴性的蛋白水解酶的Lon酶(共有絲氨酸蛋白水解酶和ATP泵酶結構的多功能酶)。Goldberg等人從Lon酶的經驗出發，堅信真核細胞中也存在ATP依賴性的蛋白水解酶，而在當時，發現並建立了網織紅細胞系統的Goldberg團隊對探明ATP依賴性機制也擁有絕對的信心，但在這場大戲中確有意想不到的劇情出現，將他們所預想奪取到的“探明在真核細胞中ATP依賴性的蛋白質分解機制”的光榮全部奪走，打破Goldberg團隊美夢的就是巨星Hershko和Varshavsky.

從APF-1的認定到泛素的發現

Hershko在60年代後期，在以倡導“誘導酶”而聞名的Tomkin研究室中報告了類固醇激素誘導的酪氨酸轉移酶的半衰期顯著縮短，其分解代謝需要能量。1971年，他回到了祖國以色列，繼續進行蛋白質分解的研究，1977年受到使用網織紅細胞的Goldberg等人的“ATP依賴性的蛋白分解系統”等相關論文的啟發，同當時是研究生的Ciechanover一同進行探明其機制的工作。他們採用化學方法分離，純化網織紅細胞提取液中的階段性的相關因子。很快的，在1978年得到了通過DEAE-cellulose方法的“階段1”和採用吸附高濃度鹽析的“階段2”。幸運的是，這些操作只是通常的為了將紅血球內大量的血紅蛋白除去的生化學解析方法。階段1和階段2單獨幾乎難以見到ATP的促進效應，但當二者混合時，可以觀察到ATP的促進效應。這個結果，顯示了ATP依賴性的蛋白質分解路徑是複合的，並以簡報的形式刊載在BBRC(1978)上。他們將這篇小論文作為自己最值得自豪的業績，即便在現在的講演中，也常常提及。

此後不久，在階段1中成功提純ATP-dependent proteolysis factor(APF-1)。APF-1是熱穩定性很好的小分子蛋白。當時推想，APF-1是階段2內存在的尚未認定的蛋白水解酶的活化因子，採用I125標記的APF-1以檢測其相互作用的分子。但結果出現了令人驚奇的現象，125I -APF-1是以高分子梯狀出現的，而且明確了這個修飾反應在ATP加水分解反應中是必要的。現在這個現象作為聚泛素化的現象是很自然的事情，但在當時不難想象他們驚訝的程度。與原來的預想不同，1980年，APF-1被認為是底物蛋白質與所消耗的能量共價結合的產物。

現在有必要介紹一下泛素的研究歷史，最初在1975年，Goldstein把它當作胸腺激素的一種發現的，但不久就明確了其不過是標本中混入的物質，也就是說，泛素是一種“被錯誤發現的分子”。但是正是在這個研究，創造了“泛素”這個名字得以流傳史冊。Goldstein等人，為了強調這個物質在所有的組織細胞中普遍存在，即其普遍性（ubiquity）,稱其為泛素（ubiquitin）。在1977年，Goldknopf和Busch在細胞周期的研究中認定了在染色體的組蛋白2A中與其異肽鏈結合的分子為泛素。這篇“泛素與蛋白質共價結合”文章為明確泛素修飾反應機制帶來了光明。接著，在1980年，Hershko與其共同研究者一道證明了APF-1和泛素是同一物質。再次驗證了泛素的功能。

Hershko的泛素假說

很快Hershko和Ciechanover提出了泛素在蛋白質分解中所起的基本作用的假說：泛素通過E1（活化酶）,E2（結合酶）,E3（連接酶）的多級反應，與目標蛋白共價結合，多數泛素分子枝狀連接，形成聚泛素鏈，而聚泛素鏈成為蛋白水解酶攻擊的標記，被捕捉到的目標蛋白被迅速的分解。這個“泛素假說”後來得到廣泛的稱讚。這個假說的要點在於代謝能量是泛素活化所必須的，從概念上講，ATP的消耗在了蛋白分解的信號形成上了。這個假說，對於Goldberg等人所預想的ATP依賴性的蛋白水解酶的概念完全不同，這種對能量依賴性蛋白質分解機制的解釋不亞於晴天驚雷。有必要說明的是，這一系列的研究的是由生物化學方法所取得的，而和當時蓬勃發展的分子生物學技術並無關聯。

在Hershko和Ciechanover提出泛素假說的最初5年間竟然沒有競爭對手的出現，這在和平年代里是極為罕見的。當然，這也與當時大家都難以相信這種“當時難以想象的現象”有關，對於他們的假說的可信度人們總是投去懷疑的目光。這也是獨創性到達了超世的境界，高處不勝寒的典型例子。但這種獨創性過高的同時也常常帶了些不幸。由於其超出常識，Nature,Science等世界超一流的雜誌也不相信他們的發現，在很長一段時間內拒絕刊登。

Varshavsky的遺傳學的研究

對於泛素系統離體作用的證明中，貢獻最大的是Varshavsky和他的共同研究者，其門生很多，（Finley, Jentsch, Hochstrasser 等），現在仍然作為這個世界的帶頭人活躍著。Varshavsky在1977年，從原蘇聯莫斯科染色體研究所移居到了美國波士頓的MIT（麻省理工）。當時他主要在進行染色體的研究，由於這個關係，他注意到了Goldknopf和Busch關於泛素修飾的報告，並且圍繞泛素化的組蛋白H2A的染色體相關機能進行了研究。以這個為契機，1980年左右，Varshavsky開始使用出芽酵母的逆遺傳學技術對泛素系統進行研究。接著，將Hershko等在生化學所認定的E1,E2,E3等酶群所對應的酵母基因一個一個的分離出來。這些研究將明確了泛素鏈作為細胞體內實際分解信號的機能，將“泛素假說”的假說在文字上去掉了。同時他們以一連串的遺傳學的研究取得了關於泛素系統相關的許多前瞻性的研究 成果。在當時，這一連串在Nature, Science, Cell雜誌上發表的論文，在5年間席捲蛋白質分解的世界。考慮到他們的研究對後來人的影響，他們的工作是值得大加讚揚的。

蛋白質水解酶體的發現

作為精彩的範例，“泛素假說”從能量依賴性的蛋白質分解機制的觀點來看，仍然有一個重大的缺陷，這就是泛素修飾只是ATP消耗的一個裝置而已。1983年，筆者和Goldberg通過證明泛素修飾后的蛋白質分解仍然需要ATP的加水分解，因而主張“在蛋白質分解的過程中ATP依賴性的2段學說”。也就是說，雖然已經證明泛素以能量依賴性的信號附加機制，作為蛋白水解酶的攻擊標識這個概念是正確的，但是實際上泛素修飾后的蛋白質分解仍然需要能量。這個假說的要點在於作為第二個ATP的消耗的分子機制，與原核生物一樣，真核生物也存在著同樣的ATP依賴性蛋白水解酶。這意味著在泛素登場前Goldberg的預測，一半是正確的。這個推斷帶來了稱為蛋白水解酶體的ATP 依賴性的蛋白水解酶的發現。蛋白水解酶體最早出現在科學雜誌上是1988年，但搞明白它的分子結構是在10多年以後。花費如此長的時間的理由在於這個酶體是一個分子量達到250萬，總的亞基數達100個的生命科學史上最大最複雜的分子集合體。

蛋白質水解酶體是和已知的蛋白水解酶從概念上完全不同的新奇酶體，它的發現路程，可以稱得上是一部電視連續劇。筆者作為這個酶體發現及其之後的研究進展的當事人之一，很遺憾將不能在這裡講述“蛋白質水解酶發現故事”，不過，有興趣的讀者可以去看看我的個人主頁

泛素生物學研究的導火線

本文講述的不過是泛素髮現的故事，對於其後泛素研究的進展，是難以用一言兩語概括的。有關泛素依賴性蛋白質分解系統的生物學飛躍發展，而由這種突破所帶來的是發現與其相關的疾病和患者也是愈來愈多。本文只想記述有關其生物學發現前驅性研究的一個例子。1980年，在進行細胞周期研究的一個日本團隊（東京大學名譽教授山田正篤等）分離了可以誘導染色體異常凝固的溫度感受性的變異細胞ts85，並報告了在將這個細胞進行非限制溫度下培養時發現修飾組蛋白H2A的泛素消失。當時，對組蛋白泛素化研究的Varshavsky，注意到了這篇論文，獲得了ts85細胞，證實了ts85細胞存在泛素活化酶E1的變異，並使用這種細胞證明了泛素參與短壽命蛋白質分解的。這篇1984年的報告是最初關於泛素系統在細胞內生理機能的里程碑式的論文。同時對ts85細胞研究也成為了研究泛素在控制細胞周期中重要性的重要手段。

1983年，Hunt發現了在細胞分裂期間周期性變動的蛋白質CyclinB, 接著在1991年，由Hershko團隊和Kirschner各自獨立發表了CyclinB的周期性分解和泛素依賴性蛋白質分解系統相關的論文，細胞周期的研究從此掀開了新的一頁。接著，Hershko通過生化學的方法分離出CyclinB泛素化的E3連接酶，命名為cyclosome。這個多少有些誇大其詞的名稱來自能夠檢測到泛素化的CyclinB與其有20S的巨大分別。但是cyclosome最初也被投以懷疑的眼光。“所謂E3酶會不會是膜或是其他什麼的尚未認定的分子的結合的產物呢？”等等疑問不絕於耳。而在1996年，出現了將這些疑問完全打消的事件。世界上幾個不同的研究團隊探明了cyclosome也稱為APC(anaphase-promoting complex)的分子結構。其結果探明了APC是由10幾個亞體構成的巨大分子複合體。現在成這個酶為APC/C。接著，京都大學的柳田充弘教授和Kim Nasmyth通過分離正在分離的染色體中異常誘導的酵母基因組，明確了APC/C構成亞基和其多數情況下的靶分子。這是證明在細胞周期控制中，泛素依賴性的蛋白分解系統的重要性的決定性事件。這個結果揭開了ts85細胞在非允許溫度下染色體異常凝固的謎團，也使得對細胞周期M期，也就是染色體分配的機制的研究到達了分子水平。在以後對細胞周期的研究中，泛素系統的重要性也變得愈來愈重要。特別是SCF和Mdm2等新泛素連接酶的發現，對它們的研究，證實了在細胞周期的順利進行中，check point的調控中泛素依賴性的蛋白質分解的中心作用。這些結果，確立了細胞周期是由蛋白質的磷酸化反應與泛素控制的蛋白水解控制的概念，這被稱為近年來癌研究的最大成果。

其後對泛素的研究

距離1984年Finley,　Ciechanover, Varshavsky　使用ts85細胞，在Cell雜誌上發表了“泛素與細胞內蛋白質分解相關”的文章已經20年了。2004年，Cell雜誌為了紀念這個發現，刊登了當事人的回憶文章。按照與這個發現有關的Pickart的回憶，1984年與泛素相關的文章不足100篇，2003年已經超過了1000篇。這也從側面反映了泛素研究的飛速發展。而且在生命科學領域的頂級雜誌Nature, Science, Cell中，每期都登載有“泛素話題”，現在關於泛素的研究仍然處於未見衰減的快速發展中。泛素—蛋白水解酶體作為決定體內眾多生體反應能夠快速，順序，一過性，單向進行的合理手段，在細胞周期，凋亡，代謝調節，免疫應答，信號傳遞，轉錄控制，質量管理，應激應答，DNA修復等生命科學中眾多領域起到了中心的作用，已經成為了難以動搖的事實。

對泛素的研究也取得了意想不到成果。舉一個例子，最初提到的組蛋白的泛素化的研究中，也清楚了泛素也具有除了蛋白質分解外的機能，例如，現在已經探明，在胞飲，小泡運輸等的選擇，病毒的出芽等細胞內的物質流通系統，或是DNA修復，翻譯控制，信號傳遞中，泛素是起到了信號分子的作用。再舉一個例子，細胞存在著許多類似泛素分子（即泛素樣蛋白質），它們獨立形成了巨大的“蛋白質的由蛋白質進行的對蛋白質翻譯后的修飾系統”。它們對通過基因信息的增幅基因的進行控制，能夠發揮基因模體上沒有的功能。更令人驚訝的是，泛素相關聯的基因群，占基因總數的2-3%。泛素，真的是難以說是一種普通的蛋白質。

泛素的發現中做出貢獻的Hershko, Ciechanover, Varshavsky在2000年被授予Albert Lasker Award。ershko, Goldberg,　Varshavsky等所發起的FASEB Summer Conference “Ubiquitin and Protein Degradation”對泛素的研究進展有重大貢獻。第一屆在1989年，以後隔年召開，2004年為第8屆。第一屆的時候，參加者主要是上面3位偉人與其弟子。不過是泛素研究者的小型聚會。現在，這種情況已經改變，參加者半數以上是筆者不認識的年輕研究者。加之從2003年開始，由CSH symposium組織的“泛素之家”，今後，這兩個會議將交替每年舉行。而且關於蛋白水解酶將於2005年在Clermont-Ferrand(法國)舉行第6屆Proteasome Workshop。這些定期的國際會議以外，Keystone Symposium和EMBO workshop還對泛素話題頻繁舉行不定期的會議。從這些情況來看，現在泛素的正處在蓬勃發展的時期。但令人遺憾的是，高潮之後的世界將是怎樣的，仍然是未知的。果真能夠給生命的理解帶來福音么，或是仍然徘徊在謎亂的深淵。對於筆者個人來說，雖然並不指望過長的壽命，但想在泛素的研究看見完結的曙光時告別這個世界。

諾貝爾化學獎

2000年Hershko, Ciechanover, Varshavsky獲得Albert Lasker 基礎醫學獎。這個獎被稱為其獲得者的一半將獲得諾貝爾獎，從這個時候起，泛素開始被視為諾貝爾獎的候選者。在第二年也就是2001年，以“Regulation of cellular function by the ubiquitin-proteasomesystem”為題目的第34回諾貝爾學會在斯德哥爾摩的Karolinska研究所召開，這次會議除了Hershko, Ciechanover, Varshavsky，Goldberg等人，還召集了細胞周期，免疫，神經等關於這方面研究的專家。接著，就如大家所知道的那樣，2004年，Hershko, Ciechanover, Rose 等3人獲得了諾貝爾化學獎。

對於這個諾貝爾獎的獲得，無論是當事人還是相關領域的研究者都是既歡迎又驚訝的。因為竟然“沒有Varshavsky而是Rose”，“不是醫學生理學獎而是化學獎”。

相關影響

Rose是使用ATP的酶反應學的權威，在初期和Hershko, Ciechanover共同進行研究，對泛素修飾反應的機制的探明有重大的功績。其後，其在人才的培育上也有非凡的成就。在最初使用生化學手段主張泛素假說，這3名學者有極大的功績。

我個人的看法，Varshavsky未能獲得諾貝爾獎的確是非常令人遺憾的。如果沒有Varshavsky的傑出工作，現在對泛素的研究也難以擴展到現在這個地步。而且，Varshavsky在Nature, Cell, Science等雜誌上刊登關於泛素系統的論文有數十篇之多。與此相對的是，此次獲獎的3人幾乎為0。大概這個所代表的意義是，現代的基因工學，分子生物學等現代技術的快速發展，這種進步的本身就應該帶來人體基因解析的大幅進步，而這回這3個人使用的以前生化學和酶學的基礎性的所謂低技術而有了這種新概念的發現，有特別重大的意義。因此，授予諾貝爾獎是對這種獨創發現的最初發現的表彰吧。諾貝爾委員會正是標榜自己來表彰這種“最初的發現”的。現代高度發展的生命科學量產了大量論文，而這回諾貝爾化學獎的授予也可以說是為這種真正帶有獨創意味的發現所做得特別警示吧。

另外還有一件事，使這回得獎后在nature刊登的軼事。Hershko在諾貝爾醫學和生理學獎頒布的第二天，他原來計劃準備和孫女一起去游泳，結果從由堂兄打來的電話得到了被授予諾貝爾化學獎的消息（諾貝爾委員會是使用電報通知受獎者，而在這之前廣播播發了簡訊，聽到了這個消息的堂兄通知了本人）。也就是，對獲得化學獎是極其意外的。是的，近年來，泛素的研究在醫學，病態生理學等領域日漸擴大，很多人認為更應該授予醫學生理學獎，實際上卻是化學獎。這個化學獎，有必要把目光放在蛋白質作為配體的獨特調節機制的發現及其生物學意義這一焦點問題，進行正確地認識。Hershko的智慧，Ciechanover卓越的技術和行動力，Rose深刻的酶學素養，這3個個性和才能毫不相同的科學家共同努力的結果，建立了泛素作為蛋白質分解信號的假說。從這3個人對確立基本概念的貢獻出發，我想大概能夠理解諾貝爾化學獎的意義。