半不連續複製

DNA複製是一種在所有的生物體內都會發生的生物學過程，是生物遺傳的基礎。對於雙鏈DNA，即絕大部分生物體內的DNA來說，在正常情況下，這個過程開始於一個親代DNA分子，最後產生出兩個相同的子代DNA分子。親代雙鏈DNA分子的每一條單鏈都被作為模板，用以合成新的互補單鏈，這一過程被稱為半保留複製。細胞的校正機制確保了DNA複製近乎完美的準確性。

DNA複製的最主要特點是半保留複製，另外，它還是半不連續複製(Semidiscontinuous replication)。半不連續模型是DNA複製的基本過程。

問題的提出

DNA兩條鏈反向平行，一條鏈走向為5‘→3‘，另一條鏈為3‘→5‘，但所有DNA聚合酶合成方向都是在引物3‘-OH上合成，使鏈從5‘→3‘延長，那麼5‘→3‘鏈是如何同時作為模板複製呢？

1968年岡崎提出DNA不連續複製模型（P418圖34-18），認為新合成的3‘→5‘走向的DNA鏈實際上是有許多5‘→3‘方向合成的DNA片斷連接起來的。

DNA半不連續複製

DNA複製時，以3‘→5‘走向為模板的一條鏈合成方向為5‘→3‘，與複製叉方向一致，稱為前導鏈；另一條以5‘→3‘走向為模板鏈的合成鏈走向與複製叉移動的方向相反，稱為滯后鏈，其合成是不連續的，先形成許多不連續的片斷（岡崎片斷），最後連成一條完整的DNA鏈。

DNA合成由RNA引物引發

DNA聚合酶不能發動新鏈的合成，只能催化已有鏈的延長；RNA聚合酶則不同，只要有模板存在，不需引物，就可以合成新RNA鏈。因此在體內先由RNA聚合酶合成RNA引物，DNA聚合酶再從RNA引物的3‘-OH端開始合成新的DNA鏈。催化RNA引物合成的酶稱為引物合成酶。

引物長度通常只有幾個~10多個核苷酸，岡崎片斷合成也需要引物。RNA引物的消除和缺口填補是由DNA聚合酶Ⅰ完成的，最後由DNA連接酶連接。

DNA複製的複雜性保證了複製的高度忠實性

E.coli複製時，每個鹼基對錯配頻率為10-9~10-10，是高保真系統。

新DNA鏈合成時需引物，引物后又要切除，再以DNA鏈取代，DNA聚合酶在合成時還有校對功能，每引入一個核苷酸都要複查一次，未核實則不能繼續進行聚合反應。

在複製過程中還有許多輔助蛋白，E.coli就至少有15種。複製叉的複雜結構進一步提高複製準確性。

DNA複製還存在正調控和負調控，調控分子可以是蛋白質，也可以是RNA。

（一）複製叉由5’向3’方向連續複製，稱為前導鏈；另一條鏈複製叉由3’向5’移動，而DNA複製方向不變，形成許多不連續片段，稱為岡崎片段，最後連接成完整的DNA，稱為滯后鏈。

（二）首先由引物合成酶由5’向3’方向合成10個核苷酸以內的RNA引物，然後聚合酶III在引物3’-羥基上合成DNA，再由聚合酶I切除引物，填補空白，最後DNA連接酶將岡崎片段連接起來，形成完整DNA。

（三）複製具有高度忠實性，其錯配幾率約為10-10，從熱力學上考慮，鹼基發生錯配的幾率約為10-2，酶對底物的選擇作用和校正作用各使錯配幾率下降10-2，所以體外合成DNA的錯配幾率為10-6。體內複製叉的複雜結構提高了複製的準確性，修復系統對錯配加以糾正，進一步提高了複製的忠實性。

岡崎片段：相對比較短的DNA鏈（大約1000核苷酸殘基），是在DNA的滯后鏈的不連續合成期間生成的片段，這是ReijiOkazaki在DNA合成實驗中添加放射性的脫氧核苷酸前體觀察到的。

DNA複製過程中,2條新生鏈都只能從5端向3端延伸，前導鏈連續合成，滯后鏈分段合成。這些分段合成的新生DNA片段稱岡崎片段。細菌岡崎片段長度1000-2000核苷酸,真核生物岡崎片段長度100-200核苷酸。在連續合成的前導鏈中,U-糖苷酶和AP內切酶也會在錯配鹼基U處切斷前導鏈.

任何一種DNA聚合酶合成方向都是從5'向3'方向延伸，而DNA模板鏈是反向平行的雙鏈，這樣在一條鏈上，DNA合成方向和複製移動方向相同（前導鏈），而在另一條模板上卻是相反的（后滯鏈）。那麼在複製叉中新鏈是如何合成的呢？1968年岡崎（Okazaki）及其同事進行了一系列實驗，回答了這一問題。

脈衝標記實驗（pulse-labelingexperiment）。以E.coli為材料，在培養時，培養基中加入同位素[3H]標記的dTTP，經30秒后，DNA剛開始複製，分離DNA，然後在鹼中沉澱，變性，讓新合成的單鏈和模板鏈分開，再用CsCl密度梯度離心，以沉降的快慢來確定片段的大小，再檢測放射標記，結果表明被3H標記的片段，也就是新合成的片段，沉澱係數為20S左右，即都是長1000~2000Nt的DNA片段，而親本鏈要比它大20~50倍；第二組實驗是脈衝追逐實驗。目的是檢測早期合成的DNA片段以後的命運又是如何的？是依然如舊的短片段，還是連接成了長片段。這個實驗是先進行標記培養30秒，以後除去同位素繼續培養幾分鐘，再分離DNA在鹼中沉澱，檢測結果。先合成的（帶標記）的DNA不再是短片段，而和總DNA的情況相似，沉澱係數為70S~120S較長的片段，這意味著剛開始合成的片段都是短片段，以後再連接成長片段，人們就把最初合成的短片段稱為岡崎片段（Okazakifragment）。由於這個實驗的結果使得人們普遍認為：無論是前導鏈還是后滯鏈都是先合成小片段，然後在連成大片段，稱為“不連續複製“（discontinuousreplication）。然而由模型預測應該只有一半放射標記存在於小片段中，但實驗的結果卻全部是小片段DNA，為什麼從前導鏈模板的3′-OH端延伸會不連續合成呢？人們在思考這個問題。

1978年Olivera提出了半不連續（semidiscontinuous）複製模型，也就是說前導鏈上的合成是連續的，只有后滯鏈上的合成才是半連續的。

現在已經弄清原來是由於細胞內都存在有dTTP和dUTP，而DNApolⅢ卻並不能區分它們，因此也會將dUTP加入到DNA中，形成A·U對。那麼在DNA中為什麼沒有U的存在呢？這是因為E.coli細胞里有雙重“保險”，防止了U的“混入”。第一道關是細胞里的dUTPase，它能使dUTP變成dUMP，dUMP是不能作為DNA合成的底物，這樣它就不再能加入DNA中。但總還有些漏網之“魚”，它們還是逃過此關，混入DNA中，這就靠第二道關來清除“異己”，這道關的主角是尿嘧啶N-糖苷酶（uracilN-glycosylase），它可以切斷混合尿苷的糖苷鍵，形成無Pu和Py位點（apurinicorapyrimidinic，AP），再由AP內切酶在AP位點切出一個缺口，進一步進行切除修復。在細胞內尿嘧啶N-糖苷酶作用較快，而AP酶作用較慢，在新鏈合成之初約1200bp就有可能摻進一個U，但很快就被尿嘧啶N-糖苷酶切斷糖苷鍵，在AP酶未作用前在脈衝標記實驗中就提取了，用NaOH沉澱時，AP位點十分易斷裂，所以前導鏈也成了小片段。以下實驗證實了這個解釋：

(1)在dut-突變體（dUTPase缺失）中岡崎片段比在dut中為短。這是因為U摻入機會增加；

(2)在ung-（尿嘧啶N-糖苷酶缺失）突變體中，新合成的DNA約有一半由片段組成。這是(3)因為尿嘧啶N-糖苷酶缺失，不會切除U的糖苷鏈，也就不會出現AP位點，所以鹼沉澱時不易斷裂，從而保持了半不連續的原貌。

在dut-,ung-雙突變體中，結果和實驗（2）相同，更進一步證實了此推測。

半保留複製（semiconservativereplication）：一種雙鏈脫氧核糖核酸（DNA）的複製模型，其中親代雙鏈分離后，每條單鏈均作為新鏈合成的模板。因此，複製完成時將有兩個子代DNA分子，每個分子的核苷酸序列均與親代分子相同，這是1953年沃森（J.D.Watson）和克里克（F.H.C.Crick）在DNA雙螺旋結構基礎上提出的假說，1958年得到實驗證實。

1953年J．D．Watson和F．H．C．Crick在提出DNA雙螺旋結構時，對其互補關係予以很大的重視，而且提出了DNA的複製模型。DNA在進行複製時各以雙鏈中的每一條鏈作為模板，各個和互補的前體單核苷酸配對重合而形成與這二條單鏈各各對應的雙重子螺旋二條。所謂互補就是指腺嘌呤一定只與胸腺嘧啶配對，鳥嘌呤一定只與胞嘧啶配對，新的單核苷酸排列在模板上時，其排列法是依原來鏈上的鹼基通過互補來決定的。這樣無論子分子與子分子間，還是子分子與母分子間，鹼基排列順序是完全相同。這樣一來具有和親本完全一樣的遺傳信息的子分子自我增殖了二倍。這時所產生的子雙重螺旋分子一條鏈是從親代原封不動的接受下來的，只有相對的一條鏈是新合成的，所以把這種複製方式稱作半保留複製。這個模型曾用重同位素標記的DNA以密度梯度離心法進行分析，或用放射性同位素標記的DNA以放射自顯影法進行測定等等，用幾種不同原理的方法，曾在從人到病毒的許多種生物中進行了驗證，肯定了這個模型的正確性和普遍性。關於DNA是以半保留方式複製這一點已被認為是生物學中最基本的肯定性原理。