DNA聚合酶

DNA聚合酶 , 以DNA為複製模板，從將DNA由5'端點開始複製到3'端的酶。 DNA聚合酶（DNA polymerase）的主要活性是催化DNA的合成（在具備模板、引物、dNTP等的情況下）

及其相輔的活性。真核細胞有5種DNA聚合酶，分別為DNA聚合酶α（定位於胞核，參與複製引發具5－3外切酶活性），β（定位於核內，參與修復，具5－3外切酶活性），γ（定位於線粒體，參與線粒體複製具5－3和3－5外切活性），δ（定位核，參與複製，具有3－5和5－3外切活性），ε（定位於核，參與損傷修復，具有3－5和5－3外切活性）。原核細胞有3種DNA聚合酶，都與DNA鏈的延長有關。DNA聚合酶I是單鏈多肽，可催化單鏈或雙鏈DNA 的延長；DNA聚合酶II則與低分子脫氧核苷酸鏈的延長有關；DNA聚合酶III在細胞中存在的數目不多，是促進DNA鏈延長的主要酶。

在50年代的中期，A. Kornberg和他的同事們就想到DNA的複製必然是一種酶的催化作用，於是決心分離出這種酶並研究其結構和作用機制。為了達到這個目的，他們分離的蛋白，然後加到體外合成系統中即同位素標記的dNTP、Mg2＋及模板DNA，經過大量的工作，於1956年終於發現了DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymerase Ⅰ，DNA pol Ⅰ）原來稱為Kornberg酶。以後又相續發現了DNA pol Ⅱ和DNA pol Ⅲ。開始人們以為DNA pol I是細菌中DNA複製主要的酶類，後來發現DNA pol Ⅰ的突變株照樣可以複製，

才清楚它並不是主角。現在已經知道在DNA複製中起主導作用的是DNA pol Ⅲ，至於pol Ⅱ的功能現在還不十分清楚。DNA聚合酶的共同特點是：（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA鏈，必須要有引物提供3'－OH；（3）合成的方向都是5'→3'（4）除聚合DNA外還有其它功能。所有原核和真核的DNA聚合酶都具有相同的合成活性，都可以在3'－OH上加核苷酸使鏈延伸，其速率為1000 Nt/min。加什麼核苷酸是根據和模板鏈上的鹼基互補的原則而定的。E.coli的DNA pol Ⅰ涉及DNA損傷修復，在半保留複製中起輔助的作用。DNA pol Ⅱ在修復損傷中也是有重要的作用。DNA pol Ⅲ是一種多亞基的蛋白。在DNA新鏈的從頭合成（de novo）中起複製酶的作用。

此酶最早在大腸桿菌中發現，以後陸續在其他原核生物及微生物中找到。

這類酶的共同性質是：以脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)為前體催化合成DNA;需要模板和引物的存在；不能起始合成新的DNA鏈；催化dNTP加到生長中的DNA鏈的3'-OH末端；催化DNA合成的方向是5'→3'。下面首先介紹大腸桿菌的DNA聚合酶，然後簡略說明一下其他原核生物的DNA聚合酶和真核生物DNA聚合酶。

聚合作用：在引物RNA'-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個將核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的專一性主要表現為新進入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對時才有催化作用。dNTP進入結合位點后，可能使酶的構象發生變化，促進3'-OH與5'-PO4結合生成磷酸二酯鍵。

若是錯誤的核苷酸進入結合位點，則不能與模板配對，無法改變酶的構象而被3'-5'外切酶活性位點所識別並切除之。3'→5'外切酶活性──校對作用：這種酶活性的主要功能是從3'→5'方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸。當反應體系中沒有反應底物dNTP時，由於沒有聚合作用而出現暫時的遊離現象，從而被3'→5'外切酶活性所降解。如果提高反應體系的溫度可以促進這種作用，這表明溫度升高使DNA生長鏈3'末端與模板發生分離的機會更多，因而降解作用加強。當向反應體系加入dNTP，而且只加放與模板互補的上述核苷酸才會使這種外切酶活性受到抑制，並繼續進行DNA的合成。由此推論，3'→5'外切酶活性的主要功能是校對作用，當加入的核苷酸與模板不互補而遊離時則被3'→5'外切酶切除，以便重新在這個位置上聚合對應的核苷酸。在某些T4噬菌體突變株中DNA複製的真實性降低，而易發生突變，從此突變株分離得到的T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性很低。相反，另外一些具有抗突變能力的T4突變株中的T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA複製真實性好，變異率低。可見，3'→5'外切酶活性對DNA複製真實性的維持是十分重要的。5'→3'外切酶活性──切除修復作用:5'→3'外切酶活性就是從5'→3'方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈，主要產生5'-脫氧核苷酸。這種酶活性只對DNA上配對部份(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力作用，方向是5'→3'。每次能切除10個核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5'→3'外切酶活力達10倍以上。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復中可能起著重要作用。對岡崎片段5'末端DNA引物的去除依賴此種外切酶活性。焦磷酸解作用:DNApolⅠ的這種活性可以催化3'末端焦磷酸解DNA分子。這種作用就是無機焦磷酸分解DNA生長鏈，可以認為是DNA聚合作用的逆反應，而且這種水解DNA鏈作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi←(dNMP)n-x+X(dNPPP)→DNA焦磷酸交換作用：催化dNTP末端的PPi同無機焦磷酸的交換反應。反應式為32P32Pi+dNPPP←dNP32P32P+PPi→DNA最後兩種作用，都要求有較高濃度的PPi，因此，在體內由於沒有足夠高的PPi而無重要意義。DNApolⅠ的DNA聚合酶活性和5'→3'外切酶活性協同作用，可以使DNA鏈上的切口向前推進，即沒有新的DNA合成，只有核苷酸的交換。這種反應叫缺口平移(Nick translation)。當雙鏈DNA上某個磷酸二酯鍵斷裂產生切口時，DNApoIⅠ能從切口開始合成新的NDA鏈，同時切除原來的舊鏈。這樣，從切口開始合成了一條與被取代的舊鏈完全相同的新鏈。如果新摻入的脫氧核苷酸三磷酸為α-32P-dNTP，則重新合成的新鏈即為帶有同位素標記的DNA分子，可以用作探針進行分子雜交實驗。儘管DNApolⅠ是第一個被鑒定的DNA聚合酶，但它不是在腸桿菌中DNA複製的主要聚合酶。主要證據如下：純化的DNApolⅠ催化dNTP摻入的速率為667鹼基/分，而體內DNA合成速率要比此高二倍數量級；大腸桿菌的一個突變株中，此酶的活力正常，但染色體DNA複製不正常；而在另一些突變株中，DNApolⅠ的活力中只是野生型的1%，但是DNA複製卻正常，而且此突變株增加了對紫外線、烷化劑等突變因素的敏感性。這表明該酶與DNA複製關係不大，而在DNA修復中起著重要的作用。

1、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(DNApolymeraseⅠ，DNApolⅠ)這是1956年由ArthurKornberg首先發現的DNA聚合酶，又稱Kornber酶。此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特點。(1)理化性質：純化的DNApolⅠ由一條多肽鏈組成，約含1000個氨基酸殘基，MW為109KD。分子含有一個二硫鍵和一個-SH基。通過二個酶分子上的-SH基與Hg2+結合產生二聚體，仍有活性。每個酶分子中含有一個Zn2+，在DNA聚合反應起著很重要的作用。每個大腸桿菌細胞中含有約400個分子，每個分子每分鐘在37℃下能催化667個核苷酸摻入正在生長的DNA鏈。經過枯草桿菌蛋白酶處理后，酶分子分裂成兩個片段，

大片段分子量為76KD，通常稱為Klenow片段，小片段的分子量為34KD。此酶的模板專一性和底物專一性均較差，它可以用人工合成的RNA作為模板，也可以用核苷酸為底物。在無模板和引物時還可以從頭合成同聚物或異聚物。DNAPolⅠ在空間結構上近似球體，直徑約65A。在酶的縱軸上有一個約20A的深溝(cleft)，帶有正電荷，這是該酶的活性中心位置，在此位置上至少有6個結合位點：模板DNA結合位點;DNA生長鏈或引物結合位點；引物末端結合位點，用以專一引物或DNA生長鏈的3'-OH;脫氧核苷三磷酸結合位點;5'→3'外切酶活性位點，用以結合生長鏈前方的5'-端脫氧核苷酸並切除之;3'→5'外切酶活性位點，用以結合和切除生長鏈上未配對的3'-端核苷酸。2、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅱ(DNApolⅡ)：DNA聚合酶Ⅰ缺陷的突變株仍能生存，這表明DNApolⅠ不是DNA複製的主要聚合酶。人們開始尋找另外的DNA聚合酶，並於1970年發現了DNApolⅡ。此酶MW為120KD，每個細胞內約有100個酶分子，但活性只有DNApolⅠ的5%。該酶的催化特性如下：(1)聚合作用：該酶催化DNA的聚合，但是對模板有特殊的要求。該酶的最適模板是雙鏈DNA而中間有空隙(gap)的單鏈DNA部份，而且該單鏈空隙部份不長於100個核苷酸。對於較長的單鏈DNA模板區該酶的聚合活性很低。(2)該酶也具有3'→5'外切酶活性，但無5'→3'外切酶活性。(3)該酶對作用底物的選擇性較強，一般只能將2-脫氧核苷酸摻入到DNA鏈中。(4)該酶不是複製的主要聚合酶，因為此酶缺陷的大腸桿菌突變株的DNA複製都正常。可能在DNA的損傷修復中該酶起到一定的作用。 3、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ(DNApolⅢ)：DNA pol Ⅲ全酶由多種亞基組成(見下表)，而且容易分解。大腸桿菌每個細胞中只有10-20個酶分子，因此不易獲得純品，為研究該酶的各種性質和功能帶來了許多困難。直到不久前，才對其性質和功能有所了解，但每個亞基的具體作用扔不十分清楚。儘管該酶在細胞內存在的數量較少，但催化脫氧核苷酸摻入DNA鏈的速率分別是DNA聚合酶Ⅱ的15倍和30倍。該酶對模板的要求與DNA聚合酶Ⅱ相同，最適模板也是鏈DNA中間有空隙的單鏈DNA，單鏈結合蛋白可以提高該酶催化單鏈DNA模板的DNA聚合作用。DNApolⅢ也有3'→5'和5'→3'外切酶活性，但是3'→5'外切酶活性的最適底物是單鏈是DNA，只產生5'-單核苷酸，不會產生二核苷酸，即每次只能從3'端開始切除一個核苷酸。5'→3'外切酶活性也要求有單鏈DNA為起始作用底物，但一旦開始后，便可作用於雙鏈區。DNA聚合酶Ⅲ是細胞內DNA複製所必需的酶，缺乏該酶的溫度突變株在限制溫度(non permissive temperature)內是不能生長的，此種突變株的裂解液也不能合DNA，但加入DNA聚合酶Ⅲ則可以恢復其合成DNA的能力。

DNA聚合酶Ⅲ的組成

亞基 分子量(×103) 其它名稱

a 140 dnaE蛋白，polC蛋白

ε 25

θ 10

τ 83

γ 52 dnaZ蛋白

δ 32 dnaX蛋白

β 40 dnaN蛋白，copolⅢ

大腸桿菌三種DNA聚合酶的特性

功能 polⅠ polⅡ polⅢ

聚合作用5'→3' + +

外切酶活性3'→5' + + +

外切酶活性5'→3' + + +

焦磷酸解和焦磷酸交換作用 + - +

模板及引物的選擇

完整的DNA雙鏈 - - -

帶引物的長單鏈DNA + - -

帶缺口的雙鏈DNA + - -

雙鏈而有間障的DNA + + +

一般性質

分子量 1 09KD 120KD ＞140KD

每細胞中的分子量 400 17-100 10-20

結構基因 polA polB polC

T4-DNA聚合酶(T4-DNApol)：近年來在枯草桿菌，鼠傷寒沙門氏桿菌等細胞及噬菌體T4、T5、T7中分離到NDA聚合酶，這裡只介紹T4DNA聚合酶。T4DNA聚合酶與大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ相似，也是一條多肽鏈，分子量亦相近，但氨基酸組成不同，它至少含有15個半胱氨酸殘基。但是，它在作用上與大腸桿菌DNApol不同；它無5'→3'外切酶活性；它需要一條有引物的單鏈DNA作模板。在有缺口的雙鏈DNA作模板時，需要有基因32蛋白的輔助(基因32蛋白在T4DNA複製中的作用和大腸桿菌單鏈結合蛋白的作用相似，基因32蛋白在複製叉處和單鏈DNA結合后可以促進雙鏈的進一步打開，並保持其單鏈狀態有利於新生鏈的合成);它利用單鏈DNA為模板進，可同時利用它作為引物，即此單鏈DNA的3'端能環繞其本身的某一順序形成氫鍵配對，3'端的未雜交部分即被T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性切去，然後在其作用下從3'-OH端開始聚合，合成該模板DNA的互補鏈，再以互補鏈為模板合成原來的單鏈DNA。

真核生物的DNA聚合酶：真核生物中也具有幾種DNA聚合酶，但這些聚合酶都沒有3'→5'或5'→3'外切酶活性。其聚合反應機制與原核生物的聚合一樣。主要的酶(佔總量的80-90%)是DNA聚合酶α，分子量為300KD，含有4個或5個亞基，主要負責染色體DNA的複製。DNA聚合酶β，

分子量為45KD，僅含有一條鏈，主要作用是修複核內DNA。第三種聚合酶γ，分子量為140KD，存在於線粒體內，負責催化線粒體DNA的複製。最近從兔的骨髓細胞質中分離到一種新的DNA聚合酶，這種酶與上述真核生物的DNA聚合酶不同，而與原核生物的聚合酶類似，具有3'→5'核酸外切酶活性，稱為DNA聚合酶δ。另外，從酵母、原蟲等低真核生物中分離到一些DNA聚合酶。一般來說，這些低等生物都沒有低分子量的DNA聚合酶β，而且與原核生物的DNA聚合酶相似，有3'→5'外切酶活性。

1953年，沃森和克里克發表了經典論文，描述DNA的化學結構，而一些科學家對它的重要性提出了最初的質疑。兩人在論文中提出，DNA的複製原理仍有待確定。當時，美國生物化學家阿瑟·科恩伯格正在密蘇里州聖路易斯市的華盛頓大學微生物學系工作，他認可了這篇論文的重要意義。由此，他開始對機體合成核酸的過程產生了興趣，尤其是合成DNA。他在這些研究中使用的是相對簡單的大腸桿菌，1956年，他發現了裝配DNA基本單位的酶。這種酶被稱為DNA聚合酶Ⅰ，它以幾種不同的變體出現在所有的生物體中。科恩伯格在論文中描述了這些發現，他的論文起初不免遭拒，但之後於1957年被著名的《生物化學期刊》接受並發表。1959年，因為確定了“DNA的生物合成機制”，他成為諾貝爾獎的共同獲得者之一。

DNA聚合酶Ⅰ(pol Ⅰ)的發現對生物學研究有著非常重要的意義，因為它在生命過程中起著核心作用，令我們認識到DNA如何進行複製與修復。在細胞分裂之前，pol Ⅰ會複製細胞DNA的所有成分。接著，母細胞將其DNA副本傳遞給每一個子細胞，由此將遺傳信息代代相傳。科恩伯格發現pol Ⅰ能讀取完整的DNA鏈，並以之作為模板合成一條新鏈，後者與原DNA鏈完全相同——這個過程和複印機複製文件沒什麼區別。

不過，複印機在複製文件時是機械性的，它並不在乎文件的內容，與此不同的是，DNA聚合酶7個子類中的某些成員能夠校對原始DNA模板，偵查、移除並改正錯誤，從而生產出一條無誤的新DNA鏈，這其中就包括DNA聚合酶Ⅰ。其他的DNA聚合酶只能複製不能修復，因此它們能夠保留基因組中的突變，或是令細胞死亡。

DNA聚合酶有多種，E.coli就有三種。通常DNA聚合酶具有以下共同特點：

①需要DNA模板，因此這類酶又稱為依賴DNA的DNA聚合酶；

②需要RNA或DNA作為引物(primer)，即DNA聚合酶不能從頭催化；

③催化dNTP加到引物的3'-OH末端，其速率為1000nt/min，因而DNA合成的方向是5’到3'；

④三種DNA聚合酶都屬於多功能酶，它們在DNA複製和修復過程的不同階段發揮作用。

原核生物

大腸桿菌DNA聚合酶DNA聚合酶最早在E.coli中發現，到目前為止已確定有5種類型，分別為DNA聚合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅱ、DNA聚合酶Ⅲ、DNA聚合酶Ⅳ和DNA聚合酶V，都與DNA鏈的延長有關。

其中DNA聚合酶I、Ⅱ、Ⅲ研究得比較明確。

DNA聚合酶Ⅰ是1956年由Arthur Komberg在E.coli中首先發現，是一種多功能酶，有三個不同的活性中心：

①5’一3’聚合酶活性催化DNA鏈的延伸，主要用於填補DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙；

②3’一5’外切酶活性能識別和切除DNA 3’端在聚合作用中錯誤配對的核苷酸，起到校讀作用；

③5’一3’外切酶活性主要用於切除5’引物或受損傷的DNA。此酶缺陷的突變株仍能生存，表明DNA聚合酶I不是DNA複製的主要聚合酶。

DNA聚合酶Ⅱ是一種多酶複合體，有5’—3’聚合酶活性中心和3’—5 ’外切酶活性中心，但沒有5 ’—3’外切酶活性中心。其催化5’—3’方向合成反應的活性只有DNA聚合酶Ⅰ的5%。因該酶缺陷的E.coli突變株的DNA複製都正常，所以也不是DNA複製的主要聚合酶，可能是在DNA的損傷修復中起到一定的作用。

DNA聚合酶Ⅲ是一種多酶複合體，全酶由α、β、γ、δ、ε、θ、τ、χ和ψ中共10種亞基構成，其中α、ε和θ亞基構成全酶的核心。α亞基含5’—3’聚合酶活性中心，ε亞基含3’一5’外切酶活性中心，θ亞基可能起裝配作用，其他亞基各有不同作用。DNA聚合酶Ⅲ活性最高，在DNA複製鏈的延長上起著主導作用，是催化DNA複製合成的主要酶。

DNA聚合酶Ⅳ和V發現於1999年，主要參與DNA修復。

真核生物

真核生物DNA聚合酶真核生物中已發現十幾種DNA聚合酶，常見的有α、β、γ、δ和ε五種，均具有5’—3’聚合酶活性。DNAα聚合酶僅負責合成引物，DNAδ聚合酶用於合成細胞核DNA，DNA聚合酶β和DNA聚合酶ε主要參與DNA損傷修復，DNA聚合酶τ用於線粒體DNA的合成。

DNA複製的保真性是遺傳信息穩定傳代的保證。生物體至少有3種機制實現保真性：

①遵守嚴格的鹼基配對規律；

②5’—3’聚合酶活性中心對底物的選擇，使核苷酸的錯配率僅為10~10；

③3’—5’外切酶活性中心在複製出錯時的即時校對，使錯配率降至10~10。

E.coli的DNA pol Ⅰ涉及DNA損傷修復，在半保留複製中起輔助的作用。DNA polⅡ在修復損傷中也具有重要的作用。DNA polⅢ是一種多亞基的蛋白質，在DNA新鏈的從頭合成中起複制酶的作用。

複製的忠實性問題會影響到翻譯的精確性，這種忠實性主要依賴於鹼基的特異性配對。據估計每個鹼基對應的將有10個。的概率會發生錯配，但實際的錯配率只有10~10，即每1000個細菌複製周期中，每個基因組只產生一次錯誤。DNA多聚酶能增加互補鹼基的特異性，該特異性主要表現在以下兩方面：

①能夠檢查進入的鹼基是否和模板互補，這時通過一個匹配的化學特點加以識別，這是合成前的一種預防措施，稱為合成前( presynthetic)錯誤控制；

②在新的鹼基加到鏈上以後，檢查鹼基是否配對。若發生錯配，將會把剛加上去的錯誤鹼基切除掉，這是校正控制( proofreading)。

細菌的三種DNA聚合酶都具有3 7硝’外切活性，逆DNA合成方向進行加工，提供校對功能。在鏈的延伸階段中，一個核苷酸進入生長鏈的末端，形成鍵，該酶就向前移一個鹼基對，準備下一個鹼基對的進入。若一個錯誤產生了，這個酶就向回退，切除最後加進來的這個鹼基，產生一個位點，然後被正確的鹼基取代。

不同DNA多聚酶聚合和校正之間的關係是不同的。有時，這些活性是由相同的蛋白質亞基產生的，但有時它們又還有不同的亞基。一個錯誤鹼基地排除實際上是十分複雜的，因為這種切除反應是由不同位點催化的。