光學分析

光學分析可分為非光譜法及光譜法兩大類方法。

熒光分析法是DNA檢測技術中最常用的檢測方法。其原理為：在DNA靶序列 上標記熒光染料，與DNA探針雜交后，熒光雜交信號可通過熒光掃描儀或激光掃描共焦顯微鏡獲取。此法成熟穩定，但所用的掃描儀器較為昂貴，成本較高，而且熒光在空氣中易被淬滅。熒光檢測法除在DNA探針中或待測靶基因中標上熒游標記物外，也可在DNA雜交后加入熒游標記物。通過測定熒游標記嵌入DNA雙螺旋間所導致的熒光信號的變化，檢測DNA。例如，Bier等以花青二聚體YOYO及Picogreen作為與DNA雙鏈緊密親合的熒光嵌入劑，由於與DNA雜交體間的雙嵌入作用，使得完全配對、單鹼基錯配及兩個以上不匹配所產生的熒光信號有明顯不同，從而能夠明顯區分不同DNA序列，對目的基因的檢出限達到300pg/mL，循環再生60次以後，仍能有很好的靈敏度。Krull等以共價 固定在石英光纖表面的DNA探針與溶液中的靶基因雜交后，與熒光嵌入染料溴乙啶（EB）反應，根據熒光強度與溶液中互補DNA的量的正比關係進行分析，可檢測出86μg/L的DNA。用熱緩衝溶液洗去EB和另一條鏈后，可重複使用，儲存一年後活性不變。

時間分辨熒光分析法

時間分辨熒光分析法（TimeResolvedFluorescence，TRF）是在熒光分析基礎上發展起來的另一種DNA檢測技術。以常規熒光分子為標記物的傳統熒光檢測由於受到散射光、不同來源的背景熒光以及熒光淬滅等因素的影響，分析靈敏度一般僅為10^8～10^11mol/L。而某些稀土金屬(Eu、Tb、Sm、Dy）的熒光壽命較長，可達1～2ms，可消除背景熒光的干擾，因此產生了時間分辨熒光分析法。由於熒光發射峰窄、Stokes位移大和比背景熒光長得多的熒光壽命，TRF具有很高的分析靈敏度、寬闊的測量範圍、優良的分析精密性和對多個待測物同時檢測的能力。時間分辨熒光分析一般採用鑭系元素螯合物作為示蹤物。隨著納米技術的發展和應用，人們用銪螯合物染色的苯乙烯納米粒子作為標記物，其測量範圍和可靠性均得到提高。本課題組研究了在納米金上修飾銪配體化合物組裝層，通過銪離子的選擇性配合與解離實現時間分辨熒光的調控，可望用於高靈敏的DNA標記檢測。將時間分辨熒光技術應用於原位合成的DNA晶元檢測，能很好地區分雜交正錯配。

分子信標技術

分子信標技術是熒光分析方法在DNA檢測領域的又一延伸。分子信標的概念是1996年由Tyagi等提出的。分子信標是一段與特定核酸互補的DNA探針，空間結構上呈“髮夾”結構，其中環序列是與靶DNA互補的探針；莖的一端連接上一個熒光分子，另一端連上一個淬滅分子。當靶序列不存在時，分子信標呈“髮夾”結構，莖部的熒光分子與淬滅分子非常接近（7～10nm），熒光分子發出的熒光被淬滅分子吸收，此時檢測不到熒光信號；當有靶序列存在時，分子信標的環序列與靶序列特異性結合，形成穩定的雙鏈體線性結構，此時熒光分子與淬滅分子分開，產生可被檢測的熒光信號。分子信標技術具有背景信號低、靈敏度高、特異性強等優點，在DNA檢測中有著廣闊的應用前景。目前，分子信標技術已應用於PCR靶標的實時熒光定量檢測。Perlette等在袋鼠腎細胞質中注入分子信標，實時檢測了活細胞中的RNA及RNA/DNA雜交過程。通過選擇不同的熒光分子-淬滅分子對，可設計出多色分子信標，熒光系統檢測到不同顏色的熒光，可實現多個靶序列的同時檢測。另外，可利用金表面對熒光的淬滅作用，將熒游標記的“髮夾”分子固定在金表面，沒有靶序列時熒光被金表面淬滅，有靶序列雜交后產生熒光。

實際上，分子信標是一種基於熒光能量轉移（FRET）的技術。熒光能量轉移是指當熒光給體和受體間的分子距離足夠近時，發生分子間的能量轉移，熒光從一個分子向另一個分子轉移。因為DNA的存在可影響體系的能量轉移，引起熒光強度的改變，熒光能量轉移技術在DNA檢測中有著廣泛的應用。高峰等研究了吖啶橙-羅丹明B二聚體能量體系作為熒光探針用於DNA的測定。Bazan等在帶正電的共軛聚電解質(cationicconjugatedpolymers，CCP）中加入熒游標記的肽苷酸（PNA-C*），由於PNA本身不帶電，不會和共軛聚電解質發生作用。當溶液中加入和PNA互補的DNA時，DNA帶有很強的負電荷，會和帶正電的共軛聚電解質形成複合物，同時DNA和熒游標記的肽苷酸雜交，形成共軛聚電解質-DNA-(PNA-C*）的三元複合物，拉近了共軛聚電解質和熒光探針C*熒光強度即可判斷出是否有待測DNA。

半導體量子點

最近幾年以來，半導體量子點（quantumdot，QD）作為熒光探針標記物的 應用開闢了生物熒光檢測的新領域。量子點是一類由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素組成的無機熒光納米粒子，目前以CdS、CdSe、CdTe、ZnS等的研究為多。與傳統的熒光探針相比，納米晶體的激光光譜寬，同一種激發光同時激發多種量子點，可發射出不同波長的熒光；量子點的發射波長可通過控制粒徑的大小和組成材料來改變，因而可獲得多種可分辨的顏色；量子點的發射峰窄而對稱，重疊小，相互干擾小；並且量子點的光化學穩定性高，沒有熒光染料的光褪色現象。Robelek等將生物素標記的靶DNA分別與親和素標記的量子點QD565、QD655結合后，與3×4陣列的DNA探針雜交，進行了DNA的定性定量檢測。Zhang等利用兩種不同熒光波長的量子點與DNA雜交體系相結合，發展了一種均相快速檢測DNA的方法，靈敏度可達5×10^15mol/L。更多的研究者將熒光量子點與分子信標技術結合起來。Kim等將CdSe/ZnS量子點作為熒光基團，與DABCYL淬滅基團分別結合在“髮夾分子”的兩端。其研究表明，量子點與淬滅分子之間的熒光能量轉移可應用於核酸雜交研究。Zhou等將Alexa594標記的雙鏈DNA與CdSe/ZnS量子點連接，其熒光共振能量轉移效率可達88%。Krull等在CdSe/ZnS量子點表面固定DNA探針，分別與Cy3和Alexa647熒游標記的靶序列雜交，量子點與熒游標記物之間的熒光能量轉移使DNA的單色或多色熒光檢測成為可能。

化學發光（Chemiluminescence，CL）是化學物質在特定化學反應中產生光輻射的現象。當物質分子通過化學反應吸收能量，從基態躍遷到激發態，物質本身從激發態回到基態時伴有光的產生，即為化學發光。

根據激活方式的不同，主要有電致化學發光（ECL）和生物化學發光（BCL)DNA檢測。Fang等將DNA探針固定於包覆了[Ru(bpy)3]2+的SiO2納米顆粒表面，與電極表面的靶DNA雜交后測定其電化學發光信號，檢測限可達1.0×10^-13mol/L。生物化學發光一般採用酶激活化學發光。DNA樣品與探針雜交后，與化學發光底物酶結合。隨即加入化學發光底物，由於化學發光底物酶可激活底物發光，便可通過探測化學發光強度得知分子雜交情況。Maier等設計了一種以熒光底物AttophosTM代替化學發光底物的方法。Attophos在化學發光底物酶催化下，受激發射熒光可被顯著放大。

光纖感測DNA檢測

激發光在光纖內以全反射方式傳輸時產生倏逝波，激發附著在纖芯表面的熒光物質，所產生的熒光信號仍經光纖返回，由CCD相機接收，從而可檢測纖芯表面熒游標記的生物分子。光纖感測DNA檢測具有實時檢測、測量準確、特異性高的優點，成為研究者關注的熱點。

新型光纖感測器

Epstein等將光纖表面蝕刻后固定多個微球，微球上修飾有DNA探針，與熒游標記的靶DNA雜交后，可檢測多個基因序列。Zhang等報道了基於化學發光的DNA光纖感測檢測。DNA探針固定在光纖表面，與辣根過氧化物酶（HRP）標記的互補DNA雜交，然後檢測其化學發光強度。Liu等將分子信標固定在光纖表面，對靶DNA進行無標記檢測，靈敏度為1.1nmol/L。Kajikawa等將納米金顆粒固定於光纖表面，製成一種新的光纖感測器。金表面的巰基DNA與靶DNA雜交后，納米金周圍的折射率改變，引起光吸收帶的紅移和吸收強度的改變，利用這種方法同樣可以進行DNA的無標記檢測。

納米技術與DNA結合

納米技術與DNA檢測技術的結合為比色基因檢測方法的發展提供了基礎。納米金由於製備簡單、粒徑可控、生物兼容性好等優點在DNA檢測中得到了越來越廣泛的應用。納米金顆粒在鹽溶液中很容易聚集，納米金溶液的顏色對聚集程度非常敏感。Mirkin等將互補的靶DNA加入納米金標記的探針溶液中，靶序列與探針雜交后在溶液中形成以DNA雜交體為紐帶的多個Au納米粒子構成的納米金/寡核苷酸網狀聚集物，使納米金顆粒間的距離拉近，溶液顏色由紅色變為藍色。這一方法的檢測靈敏度可達10fmol/L。在高濃度靶分子存在下甚至用肉眼就可直接觀察到結果。根據不同直徑的金納米粒子產生的散射光不同，可進行寡核苷酸陣列的多色標記和檢測。

金標銀染法

在比色法中，還有一種檢測方法——金標銀染法得到了很快的發展。這種檢測方法與熒光檢測方法相比，選擇性可高出3倍，而靈敏度則可提高100倍之多。金標銀染基因檢測的基本原理，DNA探針末端標記有納米金顆粒，雜交后，銀離子在金顆粒表面沉積，被還原為單質銀而呈現出黑色的銀染信號。這種信號用肉眼就可觀察到，如果用普通的掃描儀掃描后再用相關軟體分析信號的灰度，即可得到準確的灰度值。總之，比色分析法具有無輻射，檢測儀器簡便的優點，並且沒有熒光淬滅，近年來已越來越多地用於DNA檢測的研究。

基本要求

以生成有色化合物的顯色反應為基礎，通過比較或測量有色物質溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法。比色法作為一種定量分析的方法，開始於19世紀30～40年代。比色分析對顯色反應的基本要求是：反應應具有較高的靈敏度和選擇性，反應生成的有色化合物的組成恆定且較穩定，它和顯色劑的顏色差別較大。選擇適當的顯色反應和控制好適宜的反應條件，是比色分析的關鍵。

方法

常用的比色法有兩種：目視比色法和光電比色法，兩種方法都是以朗伯-比爾定律（A=εbc）為基礎。常用的目視比色法是標準系列法，即用不同量的待測物標準溶液在完全相同的一組比色管中，先按分析步驟顯色，配成顏色逐漸遞變的標準色階。試樣溶液也在完全相同條件下顯色，和標準色階作比較，目視找出色澤最相近的那一份標準，由其中所含標準溶液的量，計算確定試樣中待測組分的含量。

光電比色法是在光電比色計上測量一系列標準溶液的吸光度，將吸光度對濃度作圖，繪製工作曲線，然後根據待測組分溶液的吸光度在工作曲線上查得其濃度或含量。與目視比色法相比，光電比色法消除了主觀誤差，提高了測量準確度，而且可以通過選擇濾光片來消除干擾，從而提高了選擇性。但光電比色計採用鎢燈光源和濾光片，只適用於可見光譜區和只能得到一定波長範圍的複合光，而不是單色光束，還有其他一些局限，使它無論在測量的準確度、靈敏度和應用範圍上都不如紫外-可見分光光度計。20世紀30～60年代，是比色法發展的旺盛時期，此後就逐漸為分光光度法所代替。

基本內容

表面等離子共振（SurfacePlasmonResonance，SPR）是一種物理光學性質，它是一種沿著金屬和電介質界面傳播的電磁波。光以一定的角度入射到界面時，若在界面發生完全內反射，會產生衰減波。若衰減波在金屬表面與自由電子耦合，則發生表面等離子體激元共振，光的反射率達到最小，此時的入射角稱為表面共振角（SPA）。SPA對與金屬表面鄰近的介質的折射率的變化很敏感，金屬表面鄰近介質的折射率不同，SPA就會不同，即使是同種材料的電介質，SPA也會因為電介質在金屬表面的量的不同而變化。ssDNA探針在金屬表面的固定以及靶序列與探針序列的雜交都會引起金屬表面鄰近的電介質改變。因此，SPR可用於基因檢測。由於表面等離子共振技術可用來測量金屬薄膜表面的待測物濃度變化，樣品無需預先進行任何標記等前處理，故可用於即時（real-time）分析。

被分析物溶液流過固定有“‘受體’的感測片表面，若發生作用而相互結合則會引起表面物質質量改變，而折射率與質量成正比，所以折射率改變，欲保證SPR發生，共振角也得隨折射率改變，改變大小與結合的被分析物質量成正比。因此通過分析共振角，就可以分析分子之間的相互作用。Jordan等利用多層鏈親和素/DNA系統放大了核酸雜交的SPR信號。利用RNaseH酶選擇性地破壞RNA/DNA雙螺旋中的RNA這一特性，Terry等[25]對DNA進行SPR成像檢測，將靈敏度放大到1fmol/L。另外，利用納米金粒子對錶面激元共振的增強作用，可以使金標后的DNA檢測靈敏度提高1000倍.SPR基因檢測的突出優點是可以進行無標記的DNA雜交反應的檢測，可以進行原位和實時的在線檢測。SPR檢測發展。方向一是檢測儀器的微型化、集成化，比如TI公司研製的一種TISPR-1型感測器，就是典型的例子；另一方向是SPR的成像研究，為DNA雜交乃至生物反應、分子動力學的研究和測試提供了新的手段。

分類

光學分析可分為非光譜法及光譜法兩大類。

非光譜法（或稱一般光學分析法）檢測被測物質的某種物理光學性質，進行定量、定性分析的方法。如折射法、旋光法、園二色散法及濁度法等。

光譜法---利用物質的光譜特徵，進行定性、定量及結構分析的方法稱為光譜法或光譜分析法。按物質能級躍遷的方向，可分為吸收光譜法（如紫外-可見分光光度法、紅外分光光度法、原子吸收分光光度法、核磁共振波譜法等）及發射光譜法（如原子發射光譜及熒光分光光度法等）。按年能級躍遷類型，可分為電子光譜、振動光譜及轉動光譜等類別。按發射或吸收輻射線的波長順序，分為Y射線、X射線、紫外線、可見及紅外光譜法、微波譜法以及電子自旋共振波譜法、核磁共振波譜法等。按被測物質對輻射吸收的檢測方法的差別（在明背景下檢測吸收暗線或是在暗背景下檢測共振明線）可分為吸收光譜法與共振波譜法兩類。按被測物質粒子的類型，可分為原子光譜、分子光譜及核磁共振波譜等。

光學分析方法（optical method of analysis ）---利用物質的光學性質進行化學分析的方法。分3種類型：（1）基於發射原理的有發射光譜化學分析、火焰光度分析、熒光X射線光譜分析、熒光分析、原子熒光譜分析等；（2）基於吸收原理的有比色分析、比濁分析、紅外線吸收光譜分析、原子吸收光譜分析等；（3）基於其他原理的還有X射線衍射分析、電子顯微鏡分析以及偏光分析等。