細胞純化
保證實驗結果可靠性的步驟
體外培養的細胞源於人或動物體內或胚胎組織，其體內的細胞都是混雜生長，每一種組織都有血管和間葉組織，因此，來源於上述組織的培養材料的原代細胞、傳代細胞絕大多數都呈混合生長，即有上皮樣細胞，又有纖維樣細胞，纖維樣細胞又包括成纖維細胞、肌細胞、骨細胞、滑膜細胞等，混雜的細胞會直接影響實驗結果，而利用體外培養細胞進行實驗研究時，為了保證實驗結果的可靠性、一致性、穩定性和可重複性，要求採用單一種類細胞來進行實驗，這樣才能對某一細胞的功能、形態等變化進行一系列研究，因而培養細胞的純化就成為實驗研究的重要一步，甚至需要從混雜的細胞群中分離出單個細胞來進行培養和開展實驗研究。
細胞的純化一般分為兩種，即自然純化和人工純化。可根據不同細胞種類、來源、實驗要求和目的選擇採用。
自然純化即利用某一種類細胞的增殖優勢，在長期傳代過程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他生長慢的細胞，靠自然增殖的潛力，最後留下生長優勢旺的細胞，達到細胞純化的目的。但這種方法常無法按照需要和實驗要求及目的來選擇細胞，此法花費時間長，留下來的往往是成纖維細胞。僅有那些惡性變的腫瘤細胞或突變的細胞可以通過此方法而保留下來，不斷純化而建立細胞系。
人工純化，即利用人為手段造成某一細胞生長有利的環境條件，抑制其他細胞的生長從而達到純化細胞的目的。
1、細胞因子依賴純化法
人和動物組織中某些細胞需要有特殊的細胞因子存在的微環境才能長期存活和生長繁殖，如IL-2是T細胞生長所必需的細胞因子，BCGF是B細胞的生長因子，體外培養中淋巴細胞若加入IL-2就可使T細胞生長繁殖，形成IL-2依賴的T細胞系，如CTLL-2細胞株，而其他細胞則自然被淘汰，採用此法還建立了IL-6依賴的細胞系，如B9、CTD7細胞株。
2、酶消化法
(1)上皮細胞與成纖維細胞的分離純化
兩者在胰蛋白酶的作用下，由於成纖維細胞先脫壁，而上皮細胞要消化相當長的時間才脫壁，特別是在原代細胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯，故可採用多次差別消化方法將上皮細胞和成纖維細胞分開，方法如下：
①採用常規消化傳代方式將0.25%胰蛋白酶注入培養瓶內兩次，每次加1mL(25mL培養瓶)來回輕搖1-2次，使胰蛋白酶流過所有細胞表面，然後倒掉。
③用彎頭吸管輕輕吹打纖維樣細胞生長的區域(可事先在鏡下用記號筆在培養瓶上劃出記號)。吹打時不要用力，也不要吹打上皮細胞生長區域。吹打結束后，再用少量培養液漂洗一遍，然後加入適量培養液於瓶內繼續培養，也可重複上述操作再進行一次，隔幾日後或下次傳代時，再進行上述操作，經過幾次處理，就可將成纖維細胞去除或將兩者分開。
(2)骨髓基質肌樣細胞的純化
在血液細胞和骨髓細胞靜置培養時，常有許多肌樣細胞和骨髓基質細胞貼壁生長，但也有許多淋巴細胞、單核細胞、粒細胞粘附其上，種類混雜，鑒於粘附細胞貼壁不牢固，也可用酶消化法使粘附細胞脫壁分離，以達到骨髓基質細胞或血液中肌樣細胞與淋巴細胞分開和純化的目的。其方法如下：
①待基質或肌樣細胞基本形成單層時，倒去舊液，加入無鈣、鎂PBS漂洗，並用力搖動后倒掉，反覆洗2~3次后，一方面可洗去血清和鈣鎂離子以助酶消化，另一方面又可使大部分粘附細胞被洗掉，但仍留有不少粘附細胞。
②將0.25%胰蛋白酶注入培養瓶內，每瓶1mL(25mL培養瓶)，輕輕搖動讓胰蛋白酶流過細胞表面，作用1~2分鐘后再輕輕搖動1~2次后倒去。
④加入含血清的培養基終止消化，再繼續用力搖動后倒掉，加入培養基繼續培養。隔幾日或下次傳代前，再進行上述操作，經過幾次處理和傳代培養后就可將粘附細胞去除，將兩者分開，達到使骨髓基質細胞或肌樣細胞純化的目的。
3、機械刮除法
原代培養時，如果上皮細胞和成纖維細胞為分區成片混雜生長，每種細胞都以小片或區域性分佈的方式生長在瓶壁上。可採用機械的方法去除不需要的細胞區域而保留需要的細胞區域，其方法如下：
(1)將要純化細胞的培養瓶，在凈化室內放在倒置顯微鏡監視下進行。
(2)用硅橡皮刮子在不需要生長的細胞區域推划，使細胞懸浮在培養液中，注意不要傷及所需細胞。
(3)推划後用培養液沖洗振搖兩次倒掉，即可將培養基加入原瓶繼續培養。
(4)數日後如發現不需要的細胞又長出，可再進行上述操作，這樣反覆多次可以純化細胞。操作過程中要嚴格無菌操作，防止污染。
4、反覆貼壁法
成纖維細胞與上皮細胞相比，其貼壁過程快，大部分細胞能在短時間內(大約10~30min)完成附著過程(但不一定完全伸展)，而上皮細胞(大部分)在短時間內不能附著或附著不穩定，稍加振蕩即浮起，利用此差別可以純化細胞。其方法如下：
(1)將細胞懸液接種在一個培養瓶內(最好培養液內不含血清，此時上皮細胞貼壁更慢)靜置20分鐘。
(2)在倒置顯微鏡下觀察，見部分細胞貼壁，稍加搖動也不浮起時，將細胞懸液倒入另一培養瓶中，繼續靜置培養20min，然後再重複上述操作后，即可將上皮細胞和成纖維細胞分隔開，在第1瓶和第2瓶以成纖維細胞為主，往後幾瓶即以上皮細胞為主，下次傳代時再按上述方法處理，就可使兩者達到完全分開的目的。
5、電烙篩選法
在貼壁細胞轉化時，往往在培養瓶的細胞層中會出現分散的轉化灶，轉化灶區域細胞密集、排列規則，有明顯生長趨勢，與周邊未能轉化的細胞有明顯的區域界限，此時即可用機械刮除法去除未轉化細胞，也可用電烙篩選法燙死未轉化細胞而保留轉化灶細胞。其方法如下：
(1)倒去舊液，並用記號筆劃出轉化灶的區域。
(2)用加熱的微型電烙器(類似焊接用的電烙鐵)將轉化灶周邊的細胞全部燙死，只保留轉化灶細胞。在單細胞克隆篩選時，也可用此法將單個細胞周圍的細胞殺死，然後在適應性培養基中(50%是舊液)繼續培養，即可達到純化的目的。