誘變

誘變

誘變操作其實很簡單，即用誘變劑直接或間接地處理生殖細胞。對細菌等生物而言，沒有體細胞與生殖細胞的區別，處理起來就更容易了。

誘變劑大致可分為四類。

物理誘變劑主要有紫外線，X—射線，γ-射線，快中子，激光，微波，離子束等。

我們知道，DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很強的紫外光吸收能力，最大的吸收峰在260nm，因此波長260nm的紫外輻射是最有效的誘變劑。對於紫外線的作用已有多種解釋，但研究的比較清楚的一個作用是使DNA分子形成嘧啶二聚體，即兩個相鄰的嘧啶共價連接，二聚體出現會減弱雙鍵間氫鍵的作用，並引起雙鏈結構扭曲變形，阻礙鹼基間的正常配對，從而有可能引起突變或死亡。另外二聚體的形成，會妨礙雙鏈的解開，因而影響DNA的複製和轉錄。總之紫外輻射可以引起鹼基轉換、顛換、移碼突變或缺失等[1]。

γ-射線屬於電離輻射，是電磁波。一般具有很高的能量，能產生電離作用，因而能直接或間接地改變DNA結構。其直接效應是，脫氧核糖的鹼基發生氧化，或脫氧核糖的化學鍵和糖-磷酸相連接的化學鍵斷裂，使得DNA的單鏈或雙鏈鍵斷裂。其間接效應是電離輻射使水或有機分子產生自由基，這些自由基與細胞中的溶質分子起作用，發生化學變化，作用於DNA分子而引起缺失和損傷。此外，電離輻射還能引起染色體畸變，發生染色體斷裂，形成染色體結構的缺失、易位和倒位等[2].

激光在微生物誘變育種方面的研究與開發應用比較晚。激光誘變育種技術研究始於20世紀60年代，經過世界各國40多年的開發應用研究，不僅證明激光和普通光在本質上都是電磁波，它們發光的微觀機制都與組成發光物質的原子、分子能量狀態和變化密切相關。激光是一種與自然光不同的輻射光，它具有能量高度集中、顏色單一、方向性好、定向性強等特性。激光通過光效應、熱效應和電磁效應的綜合作用，能使生物的染色體斷裂或形成片斷，甚至易位和基因重組[3]。

微波輻射屬於一種低能電磁輻射，具有較強生物效應的頻率範圍在300MHz~300GHz，對生物體具有熱效應和非熱效應。其熱效應是指它能引起生物體局部溫度上升，從而引起生理生化反應；非熱效應指在微波作用下，生物體會產生非溫度關聯的各種生理生化反應。在這兩種效應的綜合作用下，生物體會產生一系列突變效應。因而，微波也被用於多個領域的誘變育種，如農作物育種、禽獸育種和工業微生物育種，並取得了一定成果[4]。

離子注入是20世紀80年代初興起的一項高新技術，主要用於金屬材料表面的改性。1986年以來逐漸用於農作物育種，近年來在微生物育種中逐漸引入該技術 離子注入誘變是利用離子注入設備產生高能離子束（40~60keV）並注入生物體引起遺傳物質的永久改變，然後從變異菌株中選育優良菌株的方法。離子束對生物體有能量沉積（即注入的離子與生物體大分子發生一系列碰撞並逐步失去能量，而生物大分子逐步獲得能量進而發生鍵斷裂、原子被擊出位、生物大分子留下斷鍵或缺陷的過程）和質量沉積（即注入的離子與生物大分子形成新的分子）雙重作用，從而使生物體產生死亡、自由基間接損傷、染色體重複、易位、倒位或使DNA分子斷裂、鹼基缺失等多種生物學效應。因此，離子注入誘變可得到較高的突變率，且突變譜廣，死亡率低，正突變率高，性狀穩定[5]。

常壓室溫等離子體（Atmospheric and Room Temperature Plasma）的簡稱，（縮寫為ARTP）能夠在大氣壓下產生溫度在25-40 °C之間的、具有高活性粒子（包括處於激發態的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）濃度的等離子體射流。按照熱力學平衡狀態，等離子體可分為三種：完全熱力學平衡等離子體（也稱高溫等離子體，其電子溫度（Te）、離子溫度（Ti）和中性粒子溫度（Tn）完全一致），局部熱力學平衡等離子體（也稱熱等離子體，Te≈Ti≈Tn=3×10~3×10），以及非熱力學平衡等離子體（也稱冷等離子體，其Te≥Ti，Ti≈Tn）。

大氣壓輝光放電（Atmospheric Pressure Glow Discharge，APGD）是一個被廣泛使用的、用來描述大氣壓條件下各種氣體放電冷等離子體的總稱。在各種大氣壓非平衡放電等離子體源中，採用裸露金屬電極結構的大氣壓射頻輝光放電（Radio Frequency Atmospheric Pressure Glow Discharge，RF APGD）等離子體源是近幾年提出的一種新的大氣壓輝光放電冷等離子體源。為了從生物技術應用的角度突出這種等離子體源的特點，採用常壓室溫等離子體即ARTP來代表這種RF APGD等離子體源。

科學研究表明，等離子體中的活性粒子作用於微生物，能夠使微生物細胞壁/ 膜的結構及通透性改變，並引起基因損傷，進而使微生物基因序列及其代謝網路顯著變化，最終導致微生物產生突變。與傳統誘變方法相比，採用ARTP能夠有效造成DNA多樣性的損傷，突變率高，並易獲得遺傳穩定性良好的突變株；

ARTP是常壓室溫等離子體（Atmospheric and Room Temperature Plasma）的簡稱，能夠在大氣壓下產生溫度在25-40 °C之間的、具有高活性粒子（包括處於激發態的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）濃度的等離子體射流。

化學誘變劑主要有烷化劑（包括EMS、EI、NEU、NMU、DES、MNNG、NTG等），天然鹼基類似物，氯化鋰、亞硝基化合物、疊氮化物、鹼基類似物、抗生素、羥胺和吖啶等嵌入染料。

烷化劑通常帶有1個或多個活性烷基，此基團能夠轉移到其它電子密度高的分子上去，使鹼基許多位置上增加了烷基，從而在多方面改變氫鍵的能力。例如EMS被證明是最為有效而且負面影響小的誘變劑。與其他烷化誘變劑類似，是通過與核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反應來誘發突變。EMS誘發的突變主要通過兩個步驟來完成，首先鳥嘌呤的O6位置被烷基化，成為一個帶正電荷的季銨基團，從而發生兩種遺傳效應：一是烷化的鳥嘌呤與胸腺嘧啶配對，代替胞嘧啶，發生轉換型的突變；二是由於鳥嘌呤的N27烷基活化，糖苷鍵斷裂造成脫嘌而後在DNA複製過程中，烷基化鳥嘌呤與胸腺嘧啶配對，導致鹼基替換，即G∶C變為A∶T。當然，化學誘變存在著染色體結構和數量方面的誘導變異，但這種單一鹼基對改變而形成的點突變仍是化學誘變的主要形式。另外，誘變劑也可與核苷結構的磷酸反應，形成酯類而將核苷酸從磷酸與糖分子之間切斷，產生染色體的缺失。這些DNA結構上的變化都可能促使不表達的基因或區段被激活，而表現出被掩蓋的性狀。

另外NTG也是最有效，用得最廣泛的化學誘變劑之一。依靠NTG誘發的突變主要是GC—AT轉換，另外還有小範圍切除、移碼突變及GC對的缺失。在自然條件下NTG容易分解，而在酸性（PH5.5）條件下會產生HNO2.雖然HNO2本身就是誘變劑，但在NTG有活性時（PH6~9），它卻無誘變效果。在鹼性條件下，NTG會形成重氮甲烷（CH2N2），它是引起致死和突變的主要原因。它的效應很可能是CH2N2對DNA的烷化作用引起的[6]。

鹼基類似物是與DNA正常鹼基結構類似的化合物，能在DNA複製時取代正常鹼基摻入並與互補鹼基配對。如5-溴尿嘧啶（BU）和2-氨基嘌呤（AP），都能引起AT鹼基對轉換為GC鹼基對。

氯化鋰誘變，普遍認為是它導致AT-GC鹼基對的轉換或導致鹼基的缺失。

如疊氮化鈉（ NaN3)NaN3等電點是pH=4. 18，在pH=3時NaN3溶液中主要產生呈中性的分子HN3，易透過膜進入細胞內，以鹼基替換方式影響DNA的正常合成，從而導致點突變的產生。NaN3具有高效、無毒、便宜及使用安全等優點。

如平陽黴素（PYM），PYM是一種抗生素，屬於博萊黴素的一類。目前主要作為抗腫瘤葯應用於臨床，對多種癌症具有較好的療效。抗生素具有高度選擇性，能抑制細胞的生長，其中的大多數對維持生命有重要意義。作為一種新的誘變劑，平陽黴素能直接作用於DNA，高濃度時可使DNA鏈斷開，低濃度時能抑制連接酶，阻止胸腺嘧啶核苷酸聚合入DNA，故抑制DNA的修複合成，PYM在許多實驗中均被證明具有安全、高效、誘變頻率高、範圍大等特點。與EMS的誘變特點相近，在某些方面優於EMS，很具有開發和應用前景[7]。

如吖啶橙、溴化乙錠（EB）等可插入到DNA鹼基對之間的染料，被稱作嵌入燃料，也是較強的誘變劑，能造成兩條鏈錯位或移碼突變。

近年來，人們利用宇宙系列生物衛星、科學返回衛星、空間站及太空梭等空間飛行器，進行搭載微生物材料的空間誘變育種。通過外層空間特殊的物理化學環境，引起菌種的DNA 分子的變異和重組，從而得到生物效價更高的高產菌種。1987年以來，中國科學院微生物研究所等單位，先後利用衛星搭載了真菌、酵母、放線菌、細菌等30多種微生物菌種，經培殖后觀察發現，處理后菌種的性狀均產生了一些變異，從中選擇培育出了一些能提高抗生素和酶產量的新菌種，現已投產應用。

空間環境導致作物遺傳變異的原因尚不完全清楚，一般認為空間誘變的主要因素有以下幾點。

在衛星近地面空間條件下，環境重力明顯不同於地面，不及地面重力十分之一的微重力是影響飛行生物生長發育的重要因素之一，研究表明，微重力可能幹擾DNA損傷修復系統的正常運行，即阻礙或抑制DNA斷鏈的修復。

衛星飛行空間存在著各種質子、電子、離子、粒子、高能重粒子（HZE）、X—射線、γ—射線及其他宇宙射線。這些射線和粒子能穿透宇宙飛行器外壁，作用於飛行器內的生物，產生很高的生物效應和有效的誘變作用。

隨著基因組研究的深入和發展，中國科學院遺傳研究所的專家發現了新的誘變機制，即轉座子假說。該假說認為，太空環境將潛伏的轉座子激活，活化的轉座子通過移位、插入和丟失，導致基因變異和染色體畸變。這一新的發現為航天誘變育種機理研究增加了新的內容，加速了航天誘變育種機理的研究進程[8]。

某一菌株長期使用誘變劑之後，除產生誘變劑“疲勞效應”外，還會引起菌種生長周期延長、孢子量減少、代謝減慢等，這對發酵工藝的控制不利，在實際生產中多採用幾種誘變劑複合處理、交叉使用的方法進行菌株誘變。

複合誘變包括：兩種或多種誘變劑的先後使用，同一種誘變劑的重複作用和兩種或多種誘變劑的同時使用。普遍認為，複合誘變具有協同效應。如果兩種或兩種以上誘變劑合理搭配使用複合誘變較單一誘變效果好. 如賀筱蓉等採用紫外同平板梯度濃度的亞硝基胍、純銅蒸氣混合誘變，篩選到高產菌株效價提高了53.2%，其原理可能是激光對經理化處理的微生物細胞有修復作用，使正突變率提高。但也有複合誘變使效果降低的例子。如吳振倡等在相同的條件下銅蒸氣輻照龜裂鏈黴菌比其隨後又用氯化鋰複合處理效果好，可能是與氯化鋰提高了細胞的修復系統的活性有關[9]。

複合因子較單一因子誘變效果有很大優勢。但因目前大多微生物，尤其是抗生素產生菌的遺傳背景不清楚，往往對誘變劑，特別是複合誘變劑的選擇使用，帶有很大的盲目性。

誘變的目的是為了得到新的突變。在摩爾根時代，遺傳學研究內容的豐富與新突變的發現息息相關。現在，遺傳學研究的內容和手段與過去相比早已面目全非了，但獲得新突變並從中選出對人類有利的突變型仍然是熱點之一。培育新品種的方法現在已有許多新手段，如應用分子生物學技術培育轉基因動植物等，但誘變育種仍不失為簡便易行的常用手段。

繆勒不僅是人工誘變的創始人，也是第一位成功的誘變育種家。其實，他培育的CIB果蠅品系就是一個非常有用的果蠅新品種。20世紀30年代，瑞典的古斯塔夫松（Gustafsson）、尼布姆（Nybom）和哈格貝里（Hagbery）等就開始致力於誘變育種工作，並取得了較大成就。到50年代，瑞典已成為世界放射誘變育種研究的中心。60-70年代，誘變育種工作已成燎原之勢，經誘變而得到的新品種已數不勝數。中國在60年代初開始誘變育種工作，進入80年代后，誘變育種工作與中國其它行業一樣進入了鼎盛時期。誘變育種的成果主要體現在作物育種和微生物育種兩方面。作物育種，目標緻力於早熟、抗病、高產、優質。這些目標並不是一下子就能達到的，特別是與某些品質有一定的相關性，如早熟的難以高產，高產的不早熟，這就須一步步地進行。可以用具有某種優良品質的品種作基礎，通過誘變，從中選出保持（甚至超過）該優秀品質並出現新的優良品質的突變體。如浙江培育的早熟水稻“原豐早”，就是以“科字6號”為基礎，經誘變選擇而育成的。“原豐早”穗大粒多，耐肥抗倒，保留了“科字6號”的豐產品質，但比後者早熟45天，從而產量比成熟期相同的其它品種高一成以上。“原豐早”還有適應性廣、早晚季均可種植、二熟制或三熟制都能適應的優點。這類例子舉不勝舉，如湖北育成的“鄂麥6號”、山東育成的“魯棉1號”、黑龍江育成的“黑農16號”大豆、廣東育成的“獅選64號”花生等，都是應用誘變而培育成功的。微生物育種，目標在於獲得高產菌株。許多生化藥物如核苷酸、酶製劑、氨基酸、抗生素等，常常用微生物發酵法來進行工業化生產。由於許多生化成分在生物組織中的含量較低、提取較為困難，所以這類藥物價格極昂貴。如果某種微生物代謝途徑改變，能累積這類成分，那麼即可利用這種微生物來大量生產藥物。工業化生產的最大優點是能大幅度降低藥物的生產成本，而誘變育種可以逐漸提高藥物產量，從而進一步降低成本。在中國許多生化製藥廠的抗生素生產車間里，都有著一批專門從事菌種培育的技術人員。正是由於他們的辛勤勞動，才使得各地的生產水平逐年提高。通過誘變育種，使藥物產量逐漸提高成千上萬倍的例子屢見不鮮。

經誘變處理產生的誘變一代，以M1表示。由於受射線等誘變因素的抑制和損傷，M1的發芽率、出苗率、成株率、結實率一般較低，發育延遲，植株矮化或畸形，並出現嵌合體。但這些變化一般不能遺傳給後代。誘變引起的遺傳變異多數為隱性，因此M1一般不進行選擇，而以單株、單穗或以處理為單位收穫。誘變二代（M2）是變異最大的世代，也是選擇的關鍵時期，可根據育種目標及性狀遺傳特點選擇優良單株（穗）。多數變異是不利的，但也能出現早熟、桿矮、抗病、抗逆、品質優良等有益變異，變異頻率約為0.1～0.2%。誘變三代（M3）以後，隨著世代的增加，性狀分離減少，有些性狀一經獲得即可迅速穩定。經過幾個世代的選擇就能獲得穩定的優良突變系，再進一步試驗育成新品種。具有某些突出性狀的突變系，還可用作雜交親本。

誘變育種存在的主要問題是有益突變頻率仍然較低，變異的方向和性質尚難控制。因此提高誘變效率，迅速鑒定和篩選突變體以及探索定向誘變的途徑，是當前研究的重要課題。