骨髓細胞微核試驗

微核（Micronucleus）：染色單體或染色體的無著絲點斷片，或因紡錘體受損而丟失的整個染色體，在細胞分裂後期，仍然遺留在細胞質中。末期之後，單獨形成一個或幾個規則的次核，被包含在子細胞的胞質內，因比主核小，故稱為微核。

凡能使染色體發生斷裂或使染色體和紡錘體聯結損傷的化學物，都可用微核試驗來檢測。各種類型的骨髓細胞都可形成微核，但有核細胞的胞質少，微核與正常核葉及核的突起難以鑒別。嗜多染紅細胞是分裂後期的紅細胞由幼年發展為成熟紅細胞的一個階段，此時紅細胞的主核已排出，因胞質內含有核糖體，姬姆薩染色呈灰藍色，成熟紅細胞的核糖體已消失，被染成淡桔紅色。骨髓中嗜多染紅細胞數量充足，微核容易辨認，而且微核自發率低，因此，骨髓中嗜多染紅細胞成為微核試驗的首選細胞群。

通過適當的途徑使動物接觸受試物，一定時間后處死動物，取出骨髓，製備塗片，經固定、染色，在顯微鏡下計數含微核的嗜多染紅細胞。

生物顯微鏡、解剖剪、鑷子、止血鉗、注射器、灌胃針頭、載玻片、蓋玻片（24mm×50mm）、塑料吸瓶、紗布、濾紙等。

將濾菌的小牛血清置於56℃恆溫水浴保溫30min滅活。滅活的小牛血清通常保存於冰箱冷凍室里。

成分：Giemsa染料 3.8g

甲醇 375mL

甘油 125mL

配製：將染料和少量甲醇於乳缽里仔細研磨，再加入甲醇至375mL和甘油，混合均勻，放置37℃恆溫箱中保溫48h。保溫期間，振搖數次，促使染料的充分溶解，取出過濾，兩周後用。

成分：磷酸氫二鈉（Na2HPO4•12H2O） 19.077g

磷酸二氫鉀（KH2PO4） 1.814g

加蒸餾水至 1000mL

配製：將上述兩種成分溶於蒸餾水中。以pH試紙檢驗pH值。

取一份Giemsa染液與6份1/15mol/L磷酸鹽緩衝液混合而成。臨用現配。

小鼠是微核試驗的常規動物。體重為25g ~30g。也可選用成年大鼠，體重為150g ~200g。

實驗動物及實驗動物房應符合國家相應規定。

一般取受試物LD50的1/2、1/5、1/10、1/20等劑量，以求獲得微核的劑量-反應關係曲線。當受試物的LD50大於5g/kg體重時，可取5g/kg體重為最高劑量，一般至少設3個劑量。每個劑量組10隻動物，雌、雄性各半。另外，還應設溶劑對照和陽性物對照組。常用環磷醯胺作為陽性物對照，劑量可為40mg/kg體重。

根據受試物的理化性質（水溶性和/或脂溶性）確定受試物所用的溶劑，通常用水、植物油或食用澱粉等。

染毒途徑視實驗目的而定，建議採用經口灌胃方式。採用30h兩次給葯法，即兩次給受試物間隔24h，第二次給受試物后6h取材。

動物頸椎脫臼處死後，打開胸腔，沿著胸骨柄與肋骨交界處剪斷，剝掉附著其上的肌肉，擦凈血污，橫向剪開胸骨，暴露骨髓腔，然後用止血鉗擠出骨髓液。

將骨髓液滴在載玻片一端的小牛血清液滴里，仔細混勻。一般來講，兩節胸骨髓液塗一張片子為宜。然後，按血常規塗片法塗片，長度約2cm ~3cm。在空氣中晾乾。若立即染色，需在酒精燈火焰上方，稍微烘烤一下。

將乾燥的塗片放入甲醇液中固定5min。即使當日不染色，也應固定后保存。

將固定過的塗片放入Giemsa應用液中，染色10min ~15min，然後立即用1/15mol/L磷酸鹽緩衝液沖洗。

用濾紙及時擦乾染片背面的水滴，再用雙層濾紙輕輕按壓染片，以吸附染片上殘留的水分，再在空氣中晃動數次，以促其儘快晾乾，然後放入二甲苯中透明5min，取出滴上適量光學樹脂膠，蓋上蓋玻片，寫好標籤。

先用低倍鏡，後用高倍鏡粗略檢查，選擇細胞分佈均勻，細胞無損，著色適當的區域，再在油浸鏡下計數。雖然不計數含微核的有核細胞，但需用有核細胞形態染色完好做好判斷製片優劣的標準。

本法觀察含微核的嗜多染紅細胞。嗜多染紅細胞呈灰藍色，成熟紅細胞呈淡桔紅色。微核大多數呈單個圓形，邊緣光滑整齊，嗜色性與核質相一致，呈紫紅色或藍紫色。

每隻動物至少計數1000個嗜多染紅細胞。微核率指含有微核的嗜多染紅細胞數，以千分率（‰）表示之。若一個嗜多染紅細胞中出現兩個或兩個以上微核，仍按一個有微核細胞計數。

報告各組微核細胞率的均數和標準差，利用適當的統計學方法如Poinsson分佈u檢驗比較受試物各劑量組與溶劑對照組的微核率。

根據OECD Guidelines for Testing of Chemicals的準則，如果受試物試驗組與溶劑對照組相比，統計學上有顯著性差異，並有劑量—反應關係則可認為微核試驗陽性。

試驗報告應包括以下內容：

（1）受試物名稱、理化性狀、配製方法、所用溶劑；

（2）動物種屬和品系、體重、數量、性別、來源（註明合格證號和動物級別）；

（3）實驗動物飼養環境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、實驗動物室合格證號；

（4）劑量分組，染毒途徑和方式；

（5）試驗方法：簡述操作步驟，所用統計學方法，結果判定標準；

（6）結果：以列表方式報告受試物對動物骨髓細胞微核發生率（表1）；

（7）結論。