米酵菌酸

米酵菌酸，化學名為：3-羧甲基-17-甲氧基-6，18，21-三甲基-廿二碳-2，4，8，12，14，18-七烯二酸。20世紀30年代國外從引起人中毒的椰子發酵食品樣品中提取出該毒素，並對該毒素的理化性質和致毒機制進行了大量研究，近年來米酵菌酸又作為研究抗腫瘤疾病和細胞凋亡的一種工具試劑來使用。我國70年代從酵米面中毒樣品中分離出一種稱為“酵米面黃桿菌”（Flavobacterium farinofermen-tans no sp）的食物中毒菌，其產生的外毒素-酵米面黃桿菌毒素A（簡稱黃桿菌毒素A,flavotoxin A）現證明即為米酵菌酸。

BA作為酵米面中毒和銀耳中毒的病原菌產生的毒素之一，具有很強的生物活性，是椰毒假單胞菌引起食物中毒和死亡的主要毒性代謝產物。臨床癥狀表現為噁心嘔吐、腹痛腹脹等，重者出現黃疸、腹水、皮下出血、驚厥、抽搐、血尿、血便等肝腦腎實質性器官損害癥狀。動物實驗亦表明，BA主要作用於肝、腦和腎等實質性臟器且以細胞內的線粒體最為敏感。國外有研究表明BA作用於胰腺β細胞抑制葡萄糖引起的電活性而造成高血糖，此後又可轉為低血糖，嚴重者出現低血糖昏迷。BA除對線粒體有破壞作用外，還可使部分巰基酶失活，因此解毒時可使用L-半胱氨酸等巰基化合物恢復由BA所抑制的巰基酶活性，減輕或解除BA的毒害。此外BA具有抑菌作用，對黴菌、酵母及某些細菌均有強烈的抑制和殺滅作用，12.5μg量的BA即可在平板上形成明顯的抑菌圈。

米酵菌酸是發酵玉米面製品、變質鮮銀耳及其它變質澱粉類製品是引起中毒的主要原因，常見的食品有糯米麵湯圓、吊漿粑、小米或高粱米面製品、馬鈴薯粉條、甘薯澱粉等。椰毒假單胞菌酵米面亞種食物中毒多發生在夏、秋季節。潮濕、陰雨的天氣，再加上儲存不好，椰毒假單胞菌在食物中大量地生長繁殖，吃了這種食物就會發生中毒。米酵菌酸耐熱，一般烹調方法不能破壞其毒性，但日晒兩日後可去除94%以上變質銀耳中的毒素。

“酸湯子”中毒

2020年10月5日，黑龍江9人在家中聚餐食物中毒，已致8人死亡，1人仍在搶救。他們共同食用了自製“酸湯子”，而該食材已在冰箱冷凍1年。經流行病學調查和疾控中心採樣檢測后，在玉米面中檢出高濃度米酵菌酸，同時在患者胃液中亦有檢出，初步定性為由椰毒假單胞菌污染產生米酵菌酸引起的食物中毒事件。

進食后2~24小時出現上腹不適，噁心、嘔吐（嘔吐為胃內容物，重者呈咖啡色樣物），輕微腹瀉、頭暈、全身無力等。重者可出現皮膚黃染、肝脾腫大、皮下出血、嘔血、血尿、少尿、意識不清、煩躁不安、驚厥、抽搐、休克等，體溫一般不升高，病死率高達40%~100%。

立即手法或藥物催吐，催吐后口服活性炭，並儘快到醫院治療。凡與患者吃過同種食物的人，不論是否發病，一律送往醫院觀察、治療。

嚴禁用浸泡、霉變的玉米製作食品。家庭製備發酵穀類食品時要勤換水，保持衛生，要保證食物無異味產生，最好的預防措施是不製作、不食用酵米面。禁止出售發霉變質的銀耳。學會正確辨別銀耳的質量。正常干銀耳水泡發后，朵形完整、較大，菌片呈白色或微黃，彈性好，無異味；變質銀耳不成形、發黏、無彈性，菌片呈深黃至黃褐色，有異臭味。發好的銀耳要充分漂洗，食用前要摘除銀耳的基底部。

BA的毒性最早認為是干擾糖代謝，以後人們一直研究其機制。1959年Welling等通過動物試驗發現BA可抑制丙酮酸、α-酮戊二酸和蘋果酸的氧化，對磷酸化過程的抑制更為明顯。1970年Henderson以大鼠線粒體為材料證明了對氧化磷酸化的抑制部位不在呼吸鏈，而是線粒體膜上的ADP轉運過程。Weidemann發現BA增加ADP與線粒體內膜的親合力，阻斷ADP轉運。Lauquin則證明BA在線粒體內膜上與ADP載體形成複合物。於是吳洪娟等認為由於BA與腺嘌呤載體ANT（電壓依賴性陰離子通道）的結合，成為ANT的特異性非競爭性抑製劑，阻礙了ADP與ATP在線粒體內膜的交換，使ATP生成減少或消失；由於缺乏ATP，細胞膜上的離子泵不能發揮正常功能而效率低下，引起細胞內水鈉瀦留，細胞水腫；線粒體內膜依賴ATP的機制停止工作，造成水鈉瀦留，從而引起線粒體腫脹，嵴變短、模糊直至消失。作為細胞內進行呼吸作用和能量交換的重要場所及細胞內主要的供能器官—線粒體，它的功能消失必將導致細胞、機體的死亡。

GB 5009.189《食品安全國家標準食品中米酵菌酸的測定》

（1）原理

試樣經提取、凈化、濃縮及過濾后，經高效液相色譜儀分析，外標法定量。

（2）材料

固相萃取柱：陰離子交換柱（60mg/3mL）或等效品，臨用前依次加5.0mL甲醇和5.0mL水活化，保持柱體濕潤。

米酵菌酸：純度≥95%，或經國家認證並授予標準物質證書的標準物質。

（3）標準溶液配製

米酵菌酸標準儲備液（0.1mg/mL）：準確稱取米酵菌酸標準品1mg（精確至0.01mg），用甲醇溶解，轉移至10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。置於2°C~8°C冰箱中避光保存，有效期為6個月。

米酵菌酸標準系列工作液：分別吸取米酵菌酸標準儲備液用甲醇稀釋定容，配製成米酵菌酸濃度分別為0.3μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL的標準工作溶液。臨用時配製。

（4）分析步驟

A.固相萃取法：

提取：干試樣經粉碎過φ0.425mm篩后，稱取20g（精確至0.01g）置於錐形瓶中，加入100mL甲醇-氨水溶液；鮮（濕）試樣經剪碎、勻漿后稱取10g（精確至0.01g），加入80mL甲醇-氨水溶液。混勻，室溫下避光浸泡1h，置於超聲波振蕩器中超聲提取約30min，過濾。干試樣取濾液50mL，鮮（濕）試樣取濾液40mL。置80°C水浴中濃縮至約3mL，待凈化。

凈化：將濃縮后的試樣全部轉移到已活化的固相萃取柱中，依次用5mL水和5mL甲醇淋洗，棄去流出液，抽干萃取柱，再用6mL甲酸-甲醇溶液（2%）洗脫，收集洗脫液，於40°C±0.5°C水浴中氮吹至干，然後加入0.5mL甲醇，渦旋溶解，混勻，經微孔有機濾膜過濾後進行HPLC分析。

B.液-液萃取法

提取：干試樣經粉碎過φ0.425mm篩后，稱取20g（精確至0.01g），置於具塞錐形瓶中，加入20mL甲醇，室溫下避光浸泡1h，再加入80mL三氯甲烷和0.2mL磷酸溶液（45.4%）；鮮（濕）試樣經剪碎、勻漿后稱取10g（精確至0.01g），加入16mL甲醇，於室溫下避光浸泡1h，再加入64mL三氯甲烷和0.16mL磷酸溶液（45.4%）。振蕩30min，過濾，干試樣取濾液50mL，鮮（濕）試樣取濾液40mL。

萃取：將上述濾液分別移入150mL分液漏斗中，加入與濾液等體積的碳酸氫鈉溶液（40g/L），振搖2min，靜置待分層后，取出下層於另一分液漏斗中；再用碳酸氫鈉溶液（40g/L）10mL重複提取兩次，輕搖；將三次提取的碳酸氫鈉溶液合併，加入25mL三氯甲烷，振搖2min，靜置分層后棄去三氯甲烷，於分液漏斗中慢慢加入鹽酸溶液（6mol/L）調該溶液pH至2~3，加入石油醚50mL（鮮、濕試樣為40mL），振搖3min，靜置分層，取出石油醚層於旋蒸瓶中，再分別用石油醚30mL和20mL各提取一次（鮮、濕試樣兩次均為20mL），將石油醚層併入同一瓶中，於40°C±0.5°C水浴中旋蒸濃縮至干，用少量甲醇分次將旋蒸瓶中提取物溶解並轉移至5.0mL玻璃離心管或濃縮瓶中，於40°C±0.5°C下氮吹濃縮至干，然後加入0.5mL甲醇，渦旋溶解，混勻，經微孔有機濾膜過濾後進行HPLC分析。

（5）色譜參考條件

色譜參考條件列出如下：

a）色譜柱：C18色譜柱（柱長250mm，內徑4.6mm，粒度5μm）或同等性能的色譜柱；b）流動相：甲醇+水=75+25，水用冰乙酸調pH至2.5；

c）流速：1.0mL/min；

d）柱溫：30°C；

e）檢測波長：267nm；

f）進樣量：20μL。

（6）標準曲線的製作

分別將20μL米酵菌酸標準系列工作液注入液相色譜儀中，測定相應的峰面積，以標準工作液的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪製標準曲線。米酵菌酸標準溶液的色譜圖見圖A.1。5.4試樣溶液的測定將試樣溶液注入液相色譜儀中，以保留時間定性，同時記錄峰面積，根據標準曲線得到待測液中米酵菌酸的濃度。

（7）分析結果的表述試樣中米酵菌酸含量按式（1）計算：

X=（ρ×V×2）/m..............................（1）

式中：

X———試樣中米酵菌酸的含量，單位為微克每克（μg/g）；

ρ———由標準曲線得到的試樣溶液中米醇菌酸的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；V———試樣溶液的濃縮定容體積，單位為毫升（mL）；

2———稀釋倍數；

m———試樣質量，單位為克（g）。計算結果保留兩位有效數字。

（8）精密度

在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。

（9）其他

方法檢出限為0.005μg/g，定量限為0.015μg/g。

利用超高效液相色譜串聯質譜法測定銀耳中的米酵菌酸。樣品採用甲醇提取，混合強陰離子交換固相萃取柱（PAX）凈化，UPLCBEHC（2.1×100mm，1.7μm）色譜柱分析，以10mmol/L乙酸銨-乙腈為流動相，梯18度洗脫，串聯四級桿質譜多反應監測負離子模式檢測，基質匹配外標法定量。結果表明，米酵菌酸在1.6μg/L~80μg/L線性範圍內，相關係數（r）0.9999，檢出限0.5μg/kg，加標回收率82%~102%，相對標準偏差RSD≤8.5%。該方法快捷準確、靈敏度高，可用於銀耳中米酵菌酸的確證方法。

液相色譜-串聯質譜法、高效液相色譜-二極體陣列檢測器結合固相萃取法等新型方法。