基因擴增

細胞內選擇性複製DNA，產生大量的拷貝。如兩棲類卵母細胞在發育的早期，rRNA基因的數量擴增到1000多倍。基因擴增是通過形成幾千個核進行的，每個核里含有幾百拷貝的編碼28S、18S和5.8S的rRNA基因，最後卵母細胞中的這些rRNA基因的拷貝數幾乎達到50萬個，而在相同生物的其它類型細胞中，這些rRNA基因的拷貝數只有幾百個。卵母細胞中有如此眾多的rRNA基因拷貝，為卵細胞在受精后的發育過程中合成大量核糖體創造了條件。

至於卵母細胞中rRNA基因擴增的機制，有人認為可能是通過從染色體上分離出來的環狀DNA分子，這種環狀DNA中含有rRNA基因，但是第一個含有rRNA基因的環狀DNA是如何形成的尚不清楚。由於環狀DNA能夠通過滾環複製（rollingcirclereplication）的方式進行複製，因而能夠產生大量的rRNA基因。

為一特異蛋白質編碼的基因的拷貝數選擇性地增加而其他基因並未按比例增加的過程。在自然條件下，基因擴增是通過從染色體切除基因的重複序列再在質粒中進行染色體外複製或通過將核糖體RNA的全部重複序列生成RNA轉錄物再轉錄生成原來DNA分子的額外拷貝而實現的。在實驗室已建立了不等交換、從裂解細胞提取DNA或經過滾環複製（rollingcirclereplication）生成染色體外序列進行人工基因擴增。例如，在非洲爪蟾的卵母細胞中原有rRNA基因（rDNA）約200個拷貝，在減數分裂Ⅰ的粗線期，這個基因開始迅速複製，到雙線期它的拷貝數約為200萬個，擴增近4000倍，可用於合成10的12次方個核糖體，以滿足卵裂期和胚胎期合成大量蛋白質的需要。在果蠅中也發現了基因擴增現象。在卵巢成熟之前，卵巢顆粒細胞中產生卵殼蛋白的基因被擴增。果蠅中的卵原細胞，經4次分裂產生16個細胞，其中一個是卵母細胞（oocyte），將發育成為卵細胞，其他15個是營養細胞（nursecell），它們為卵細胞的形成提供大量的蛋白質及其他大分子物質，營養細胞之所以能夠產生大量的營養物質，是因為它們在形成的過程中發生了多次特殊的DNA複製，卵殼蛋白等基因拷貝數顯著增加。

臨床基因擴增實驗又稱PCR實驗，是專門用來檢驗艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測手段。它可以通過將病毒體內所含的基因進行擴增的方法，測出一些病毒含量不高的感染者體內是否含有特定的病毒。由於該檢測方法可以測出普通檢驗難以檢測出的病毒並具有靈敏度高、特異性高、快捷、對樣品要求低等優點，因此被臨床醫生廣為認可，已廣泛應用於醫院的臨床診斷和各防疫檢測部門的禽疫病診斷。但是，這種實驗需要有能保證絕對安全、配置合理的實驗室和非常規範的操作為前提。近年來對臨床基因擴增檢驗實驗室的建設越來越得到重視，因為它對檢測結果的可靠性、準確性和安全性起到至關重要的作用。本文主要從臨床基因擴增檢驗實驗室的平面布局，空調通風系統設計、氣流控制和污染的防制幾個方面對實驗室設計中的主要特點進行了闡述。臨床基因擴增檢驗實驗室設計的核心問題是如何避免污染。因此，實驗室的平面布局、空調通風系統設計、氣流控制等都是圍繞這個核心問題進行的。下面就對這幾個方面分別進說明。

臨床基因擴增檢驗實驗室原則上分為四個單獨的工作區域：試劑貯存和準備區、標本製備區、擴增反應混合物配製和擴增區、擴增產物分析區。為避免交叉污染，進入各個工作區域必須嚴格遵循單一方向進行，即只能從試劑貯存和準備區→標本製備區→擴增反應混合物配製和擴增區→擴增產物分析區。各實驗區之間的試劑及樣品傳遞應通過傳遞窗進行。

PCR實驗室並沒有嚴格的凈化要求，但是為避免各個實驗區域間交叉污染的可能性，宜採用全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴格控制送、排風的比例以保證各實驗區的壓力要求。

3.1試劑貯存和準備區

該實驗區主要進行的操作為貯存試劑的製備、試劑的分裝和主反應混合液的製備。試劑和用於標本製作的材料應直接運送至該區，不得經過其他區域。試劑原材料必須貯存在本區內，並在本區內製備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制，本區並沒有嚴格的要求。

3.2標本製備區

該區域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。本區的壓力梯度要求為：相對於鄰近區域為正壓，以避免從鄰近區進入本區的氣溶膠污染。另外，由於在加樣操作中可能會發生氣溶膠所致的污染，所以應避免在本區內不必要的走動。

3.3擴增反應混合物配製和擴增區

該區域主要進行的操作為DNA或cDNA擴增。此外，已製備的DNA模板和合成的cDNA（來自樣本製備區）的加入和主反應混合液（來自試劑貯存和製備區）製備成反應混合液等也可在本區內進行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區內進行。本區的壓力梯度要求為：相對於鄰近區域為負壓，以避免氣溶膠從本區漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區內的不必要的走動。個別操作如加樣等應在超凈台內進行。

3.4擴增產物分析區

該區域主要進行的操作為擴增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區域可不設。本區是最主要的擴增產物污染來源，因此對本區的壓力梯度的要求為：相對於鄰近區域為負壓，以避免擴增產物從本區擴散至其它區域。

PCR實驗室設計的核心問題是如何避免污染。在實際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴增產物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標本間的污染。由於一旦發生污染，實驗就必須停止，直到找到污染源為止，而且實驗結果必須作廢，需重新進行實驗。所以發生污染后再圍繞實驗室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣，浪費人力物力。因此要避免污染，首先應是預防，而不是排除。

4.1工作區域的嚴格劃分

⑴各個實驗區域設置合理；

⑵各個實驗區域要有明顯的標記（如醒目的門牌或不同的地面顏色等），以避免各個不同實驗區域設備物品、試劑等發生混淆。

4.2合理的系統設置

⑴合理的空調通風系統設置，盡量採用全送全排的空調系統；

⑵嚴格的氣流壓力控制，保證不同的實驗區內不同的壓力要求。

4.3規範的操作

⑴臨床基因擴增檢驗實驗室的技術人員必須進行上崗培訓，經培訓合格后才能從事臨床基因擴增檢驗的工作；

⑵在實驗操作過程中，操作者必須戴手套，並經常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施；

⑶清潔工作及時、正確。實驗工作結束后，必須立即對本區進行清潔。除常規的消毒液體對錶面進行擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外，對一些實驗設備還應進行高壓消毒處理。

4.4嚴格的管理

⑴嚴格控制進出實驗室的人員。與實驗無關的人員不得隨意進出實驗室，有條件的情況下要設置獨立的通道和進出整個實驗區的門；

⑵在各個實驗區域使用帶有明顯區別標誌的工作服（如不同顏色），當工作人員離開時不得將本區的工作服帶至其它區域；

⑶盡量減少在實驗區內不必要的走動以減少交叉污染的可能性。

⑷擴增產物分析區是最主要的擴增產物污染來源，廢液不能在實驗室中傾倒，必須經消毒液浸泡消毒后在遠離實驗室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應經消毒液浸泡消毒后統一處理，如焚燒等；

⑸擴增產物分析區可能會用到某些可致基因突變和有毒物質，應特別注意實驗人員的安全防護。

4.5完備的實驗室配套設施

完備的實驗室配套設施是保證實驗工作的必要條件，應根據各個實驗室實驗內容的不同配備相應的設備和儀器，如超凈工作台、離心機、加樣器等。

多聚酶鏈式反應的原理類似於DNA的天然複製過程。在待擴增的DNA片段兩側和與其兩側互補的兩個寡核苷酸引物，經變性、退火和延伸若干個循環后，DNA擴增2n倍。

1．變性：加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。

2．退火：使溶液溫度降至50－60℃，模板DNA與引物按鹼基配對原則互補結合，即退火階段。

3．延伸：溶液反應溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導下，利用反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按5’→3’方向複製出互補DNA，即引物的延伸階段。

上述3步為一個循環，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個階段。從理論上講，每經過一個循環，樣本中的DNA量應該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環的模板，經過25-30個循環后DNA可擴增106-109倍。典型的PCR反應體系由如下組分組成：DNA模板、反應緩衝液、dNTP、兩個合成的DNA引物、耐熱Tag聚合酶。

1.PCR熱循環儀2.移液器（0.1-2.5μL）3.PCR板

實驗試劑

1．10×緩衝液：500mmol/LKCI、100mmol/LTriS·HCI(pH8.3，室溫）、15mmol/LMgCl2

2.dNTPMix：2.5mmol/LdATP、2.5mmol/LdCTP、2.5mmol/LdGTP、2.5mmol/LdTTP

3.Tag酶5U/μL：

4.DNA模板1ng/μL：

5.引物1

6.引物2

7.引物溶液濃度2uM

1．在200ulEppendorf管內配製20ul反應體系

2．按下述程序進行擴增

94℃預變性3min；94℃變性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min30s30cycle；72℃延伸4min；4℃pause

1．引物設計應具有特異性，依靠引物設計軟體進行引物設計；引物分裝成多管，不宜反覆凍融多次；

2．PCR反應的各種成份不能遺漏，操作應戴手套，冰上操作；

3．根據引物的Tm值和擴增片段長度以及PCR儀的特性來設定PCR循環條件；

4．注意分析電泳檢測PCR產物時出現拖帶或非特異性擴增帶、無DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。

以聚合酶鏈式反應（PCR）為基礎的離體基因擴增技術對基因工程的研究和應用產生了革命性影響。提供自動化的PCR專用儀器則是推廣PCR技術的關鍵。為解決國產PCR裝置的更新換代並替代大量進口，中科院發育生物學所最近完成了以智能化儀錶控制系統為核心的乾式基因擴增PCR裝置，經多種對照引物和模板DNA的PCR實驗，獲完全成功，即將通過技術鑒定並批量生產。該儀器的研製成功為分子生物學、生物工程、醫學和法醫學鑒定及考古、環衛等研究和應用部門掌握和應用PCR技術提供了高性能價格比的新裝備。該PCR裝置採用人機對話操作方式，利用單片機小型專家系統，以豐富的智能化軟體取代了常規儀器的大部分硬體功能，使整機結構大大簡化，操作方便。工作可靠，性能精良。其別具特色的實時動態運行狀態顯示、自動整定最佳PID參數、感測器偏差補償、九組九步任意曲線串接編程、確保曲線平台和伺服起動、多種可預設上電方式、掉電保護及報警等硬體軟化功能充分顯示了智能化儀錶技術的優越性。為已有的國內外PCR裝置。

目的：為提高PCR檢測乙型肝炎病毒（HBV）的特異性和靈敏度，降低成本，對PCR條件進行優化。方法：將HBV特異性基因片段轉化到大腸桿菌DH5α中，提取質粒，利用PCR擴增HBVC區基因，對PCR條件中的退火溫度、Mg2+濃度進行優化，並比較3種不同TaqDNA聚合酶的靈敏度。結果：HBVC區基因擴增的最佳退火溫度為58℃，最佳Mg2+濃度為1.5mmol/L，BiostarTaqDNA聚合酶擴增到10-6。討論：對HBVC區基因進行了轉化和PCR實驗條件的優化，為擴大PCR在乙型肝炎病毒（HBV）檢測領域中的應用提供實驗依據。

在研究或診斷中，DNA擴增可以通過以下方法進行：

聚合酶鏈反應（PCR）：一種簡單、廉價、可靠的通過聚合核苷酸，重複複製靶標DNA片段的方法。

連接酶鏈反應（LCR）：一種擴增核酸獲得探針的基因擴增方法。對於兩條DNA鏈中的每一條，連接酶連接兩個部分探針成實際的一條。因此，LCR使用兩種酶：DNA聚合酶（用於初始模板擴增）和熱穩定的DNA連接酶。

轉錄介導的擴增：一種等溫的基因擴增方法，利用兩種酶即RNA聚合酶和逆轉錄酶，快速擴增靶標RNA/DNA。

天然基因擴增，也稱為染色體複製，或基因複製，是生物分子進化過程中產生新遺傳物質的主要機制。它指的是任何含有基因的DNA片段的複製。

基因複製可能源於DNA複製和修復錯誤，也可能源於自私遺傳元件的偶然捕獲。常見的幾種基因複製的原因包括：異位重組（重組過程的交叉發生在非同源位點）、逆轉錄事件、非整倍性、多倍性和複製滑動（滑鏈錯配）。

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