BT蛋白

蘇雲金桿菌發現有上百年的歷史：

1901年日本人石渡(Ishiwata)從病蠶屍體中分離出一株所謂碎倒細菌(sotto. bacteria)。

1911年Ernst Berliner在德國蘇雲金(Thuringia)的一個麵粉廠的地中海粉斑螟(Anagasta Ruchniela)患病幼蟲中又分離到這種產伴孢晶體的芽孢桿菌。

1915年定名為蘇雲金芽孢桿菌，一般稱蘇雲金桿菌(Bacillus thuringiensis Berliner)。Ernst Berliner指明蘇雲金桿菌含有伴胞晶體(parasporal Crystal)，但未曾說明蘇雲金桿菌的孢晶體有殺蟲作用。

從1920年到1950年這一段時期內，有許多人曾用蘇雲金桿菌進行防治害蟲的田間試驗。

1956年Angus證實殺蟲活性物質位於伴孢晶體之中。他將伴孢晶體與孢子分開之後，單獨伴孢晶體仍然存在殺蟲活性，證明了蘇雲金芽孢桿菌中的伴孢晶體蛋白是殺蟲活性的主要來源。

蘇雲金芽孢桿菌大多數菌株都能產生多種類型的伴孢晶體蛋白(parasporal crystal protein)，即δ一內毒素或殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Protein, ICP)對鱗翅目(Lepidopera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleopter)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera) 、直翅目(Orthoptera) 、食毛目(M allophaga)等多種昆蟲，以及線蟲、蠟類和原生動物等具有特異性的殺蟲活性。迄今為止，已分離測定了100多個殺蟲晶體蛋白基因序列, Bt基因已成為植物基因工程及轉基因育種中應用最廣泛，最具潛力和應用前景的抗蟲基因。

近年來，不斷發現的殺蟲晶體蛋白及其基因使得原先分類系統中的氨基酸序列與殺蟲活性間產生了不協調性，而且隨著新基因的發現，這種分類方法越來越不能滿足這兩個條件，使得分類難以確定。Crickmore等在1995年國際無脊椎動物病理學會年會(SIP)上提出了以殺蟲晶體蛋白氨基酸序列的同源性為唯一依據區別Bt基因的新分類系統，現已被各國廣泛採納。同源性在45%以下，為第一等級，用阿拉伯數字錶示；同源性在45%-78%之間，為第二等級，用大寫英文字母表示；同源性在78%-95%之間，為第三等級，用小寫英文字母表示；同源性在95%以上，為第四等級，用阿拉伯數字錶示。只要滿足來自Bt的伴抱包涵體(晶體)，與已知的cry或cyt具有高的同源性，就可以納入這個系統。

2004年1月已經發現299種殺蟲晶體蛋白基因，分屬於44群(其中cry基因42群，cyt基因2群),136模式基因。

殺蟲晶體蛋白基因在Bt中的分佈現在發現的116個殺蟲蛋白基因，分別分佈於Bt不同菌株中。不同血清型、不同亞種之間，其基因數和種類有明顯差異，1-6個不等。同一菌株的殺蟲晶體蛋白基因，也可能定位於不同的質粒上；或者多個晶體蛋白基因定位於同一質粒上；而有的則定位於染色體上"同一殺蟲晶體蛋白基因在不同的菌株中可定位於不同的質粒上，即使在同一菌株中的同一殺蟲晶體蛋白基因也可定位於不同的質粒上，甚至有的菌株的同一殺蟲晶體蛋白基因可同時定位於質粒和染色體上。

不過，另外一些人對Bt蛋白無毒性表示謹慎態度，一些實驗表明，Bt蛋白能激發黃河鯉魚的免疫系統，這說明BT蛋白可以影響脊椎動物的免疫系統（殷海成，蘇雲金芽孢桿菌對黃河鯉白細胞吞噬和溶菌酶活性的影響。河南農業科學, 2009年 04期）。

並且，更為有力的證據是，實驗表明，某些菌株（Bt9875）生產的BT蛋白可以導致HL-60等人類細胞的凋亡（竺利紅，等。蘇雲金芽孢桿菌Bt9875晶體蛋白誘導HL-60細胞凋亡。微生物學報Acta Microbiologica Sinica 48(5)：690~694;4 May 2008）。這充分證明了，BT蛋白對人類是存在著潛在毒性的。

同時，人們對Bt蛋白熱穩實驗表示懷疑，由於Bt蛋白有很多子類，在熱穩實驗中，並未提交所有的Bt蛋白子類都進行熱穩實驗，至少轉基因玉米中的一種Bt蛋白Cry9C，能夠在90攝氏度高溫持續120分鐘而不降解，如果這種蛋白存在潛在危險，那麼海拔高於3000米的居民將受到廣泛的影響。

這說明，對BT蛋白的安全性評估是不嚴謹的，或許，重新評估BT蛋白的安全性，是完全有必要的。

Bt質粒的多態性

Bt菌中普遍有質粒存在，但不同菌株質粒的數量和大小各不相同，表明了Bt質粒的多態性"根據質粒的大小和特性，可將Bt質粒分為2種類型: Ⅰ型為小質粒，分子量小於15MDa，相互之間及與大質粒和染色體都無同源性，其功能不詳；Ⅱ型為大質粒，分子量大於15MD，相互之間及與染色體間存在序列的同源性，在菌株間可通過接合方式轉移，大多數殺蟲晶體蛋白基因定位於這類質粒上。Bt不同亞種質粒數是不同的，並非任何一種質粒在所有亞種中都存在，不同亞種質粒數及大小不同，而且同一亞種不同來源的菌株，質粒數及大小也不一致，這充分反映了Bt質粒的多態性。

Bt核基因的多樣性和保守性

DNAG+Cmol%是細菌分類的重要指標之一，它反映了DNA鏈中不同類型的鹼基的相對比例。一般細菌種內個體間DNAG+Cmol%的差異不超過3%，屬內種間不超過10%；細菌群體內變化為24%-76%。Bt的G+Cmol%變化範圍在35.7%-37%，表明Bt群體中不同菌株DNAG+Cmol%組成仍存在一定異，表現出其基因組CE.鹼基組成的豐富多樣性"同時，利用DNA-DNA分子雜交分析可有效分析其不同來源菌株DNA鹼基順序同源性，實驗證明：Bt作為一個種DNA同源性達60%以上，表現出Bt基因組DNA的穩定性和保守性。

雖然Bt蛋白有很多優點，但是Bt作為生物農藥的缺陷也很明顯。

首先，它的價格很貴。

其次，它在自然環境中很不穩定。作為噴灑劑，Bt農藥很容易被雨水沖走，在紫外線的照射下也很快被分解。這就意味著農民需要多次噴灑Bt殺蟲劑，不僅麻煩，而且進一步提高了成本。隨著更加便宜的化學合成殺蟲劑的出現，Bt農藥在市場上的份額大幅度下降，只有那些堅持用有機綠色方式種植作物的農民才會使用它。不過合成殺蟲劑對環境造成了很大的破壞，而且還威脅到了人類自身的健康。所以如何改進更加環保的生物農藥，讓它們變得便宜、穩定，成了一個棘手卻重要的問題。

這個問題的解決，得益於現代生物技術的誕生。20世紀50中期，科學家發現Bt蛋白對鱗翅目動物的毒性來自孢子形成過程中產生的晶體蛋白質。1981年，Schnepf HE 和 Whiteley HR成功地提純了這種蛋白質並命名為cry。隨後他們克隆出了cry的基因。幾年以後，美國的科學家把Bt蛋白的基因轉入玉米和棉花中，讓它在植物中持續地表達出來。這樣，就不需要人工噴灑Bt蛋白了。轉基因技術和傳統的雜交育種技術並無本質的區別，但是它的可控性更好。打個比方，如果說傳統的雜交育種是盲目地將大量基因像一團亂麻一樣塞入新品種的話，那麼轉基因技術更像一把鋒利的手術刀，能夠精準地切割我們需要的基因，然後把它接入新作物中。這樣，培育新品種作物的不確定性就大大降低了。Bt轉基因作物的出現還有一個好處，因為Bt蛋白更加集中地出現在植物體內，所以誤傷非農業害蟲的幾率變低了不少。經過了10年的檢驗后，1996年，轉基因玉米和棉花在美國成功地上市。從那時算起也已經有十多年了，還沒有發現對人類健康有任何負面的影響。Bt轉基因作物對於環境的貢獻是巨大的。在美國，轉基因抗蟲棉讓殺蟲劑的使用量降低了82%。而在中國，轉基因棉的種植也讓葉農藥的使用量降低了60%-80%。

近來，有關對轉基因植物的商品化是否會導致嚴重的環境問題已經引起各方激烈的辯論，各方主要涉及的問題是轉基因植物的廣泛種植與傳播是否會加速不合需要雜草及抗農藥昆蟲的進化。許多研究資料表明，經遺傳改良植物的商品化會導致編碼有利性狀的轉基因轉移到這些植物的野生種和近緣種中。而且與目的基因緊密連鎖的標記基因或報告基因同樣存在一定的風險性。Allison等認為Bt殺蟲晶體蛋白殺蟲活性的散失將可能成為轉Bt基因植物產生的最嚴重的生態危機。有關轉Bt基因植物潛在的生態危險性，已引起生態學家、生物學家和農學家們的密切關注，這方面的研究已成為熱點。世界各國相繼制定頒布了一系列生物遺傳工程體及其產品安全性評價條例，對轉基因植物的安全性作出了嚴格的評價標準。有關轉基因植物對生態環境和食物安全性的影響已進行了不少研究，積累了一大批有價值的資料。從己商品化的轉Bt基因植物來看，還沒有關於其對生態環境產生危險性的報道，但是，轉Bt基因植物潛在的風險性必須引起重視。

轉Bt殺蟲晶體蛋白基因的沉默

限制轉基因植物向商品化、實用化方向發展的另一個重要因素是轉基因的沉默(gene silenclng)現象。發現轉CryIA (b)Bt的轉基因水稻中Cry1A(b)轉基因的沉默現象，轉基因的沉默與轉基因在受體植物中甲基化狀況、轉基因的拷貝數、插人受體植物染色體位點及轉基因是否與受體植物中有同源基因等因素有關。通過篩選單拷貝轉基因個體，採用特殊功能的啟動子和增強子，選用新的轉基因方法，如構建細胞核基質支架附著區載體等可以有效地防止轉基因的沉默。

轉Bt基因植物的性狀變異

不少文獻報道了轉基因植物會產生一系列性狀變異。Lynch等報道了轉基因水稻表現出植株變小，花期推遲，育性降低等變異。發現：轉cry1A(b),cry7A(c) Bt基因的水稻在溫室及田間生長條件下，與對照相比，轉基因水稻株系在株高、穗長、單株粒重、百粒重和結實率等方面都顯著降低，而單株有效分孽數增多，生育期推遲，落粒性增強。轉基因植物性狀變化除了由無性變異引起外，還由於外源基因的導入破壞了受體基因的活性，影響了受體植物的代謝過程，使表型發生了改變。所以在進行轉Bt殺蟲晶體蛋白基因育種時，根據育種目標，選擇優良表型且具較強殺蟲活性的轉基因植物，並積極輔助以雜交、回交、理化誘變、組織培養等育種手段，對於創造出具優良性狀的抗蟲植物至關重要。

轉Bt基因植物的出現已經為現代農業發展開創了一個新時代，但它僅僅是增加產量，帶來持續農業，保護生態環境的一系列新的安全技術的一個開端，將來仍必須開展如何合理和持續利用Bt以及如何使轉Bt基因植物與傳統農業相結合的研究，同時注重解決轉Bt基因植物中存在的問題，使轉Bt基因植物更好地服務於人類。

人類使用Bt的歷史已經有大半個世紀了。在此期間，科學家做了數不清的實驗評估Bt中cry蛋白的安全性。檢驗一種物質是否有毒，最直接的方法就是急性經口毒性檢測。科學家用純的Bt蛋白在老鼠身上做實驗。對於老鼠來說，按照每千克體重口服3.8-5g cry蛋白的量是安全的。中國的轉基因水稻中Bt蛋白含量不超過2.5微克/g，所以一個60kg的人吃120噸稻米也不會因為cry蛋白中毒。另一方面，Bt蛋白在人體內不能積累。如果把它加入胃液提取物中，所有的Bt蛋白會在0-7分鐘內被分解，這是一種容易消化的蛋白質。而且它包含了全部的人體必需氨基酸。所以對人類來說，Bt蛋白不但沒有毒性，反而還挺有營養。

對Bt蛋白的毒理研究顯示，Bt蛋白本身是無毒的，是一種原毒素。這種原毒素可以被某些昆蟲體內的酶活化，隨後能夠結合在腸道的受體上，造成腸道穿孔。人類和絕大多數動物既沒有可以激活原毒素的蛋白酶，也不存在能和Bt蛋白特異性結合的受體，所以Bt蛋白質對人類的健康沒有任何影響。很多人對Bt蛋白的恐懼來源於“蟲吃了要死，人吃了怎樣”的擔憂。這種擔憂毫無道理，人類和昆蟲本來就是完全不同的物種。番茄鹼，辣椒素都能殺蟲，但是並不妨礙番茄和辣椒成為人們喜愛的食物。

還有一些人擔心Bt蛋白會成為一種過敏原，這種擔心也是不必要的。Bt蛋白在氨基酸序列和蛋白質結構上都和人類已知的過敏原相差很大，而且沒有任何實驗證據說明它能夠引起過敏反應。美國自上世紀50年代開始大規模使用Bt蛋白作為生物農藥，迄今為止只發現了兩例有爭議的過敏案例。其中一人有嚴重的食物過敏症，所以不能確定過敏原一定是Bt蛋白----就算是Bt蛋白，也不能說明什麼，要知道美國每年因為花生過敏死亡的人數就有約100人。

一些新的cry蛋白也成功地從Bt中分離出來，它們可以殺滅不同的昆蟲種類，但是都具有特異度高的特點。某些cry蛋白可以抗鞘翅目昆蟲。土豆的頭號殺手科羅拉多甲蟲以及我國的重要的用材樹種楊樹的天敵天牛都屬於鞘翅目。另外一些cry蛋白則針對雙翅目昆蟲。雖然雙翅目昆蟲大多不是農業害蟲，但是它們能傳染疾病。蟠尾絲蟲症（Onchocerciasis）又叫河盲症（River Blindness），是僅此於沙眼之後的第二大致盲傳染病。河盲症由一種叫做黑蠅的雙翅目動物傳播，一度在非洲非常流行。1974年開始，聯合國衛生組織開展了蟠尾絲蟲症控制計劃（OCP）,這一計劃大量的使用Bt撲滅黑蠅。1985年以來，每年的Bt用量都在21萬升至40萬升之間。OCP計劃最後大獲成功，3000萬人得到了保護。據估計，因為OCP計劃直接避免盲眼的人數就有26萬5千人。Bt作為控制疾病最主要的因素之一，功不可沒。

大自然不是為了人類而設計的。自從1萬年前最原始的農業產生以後，人類就開始逐漸將天然的野生植物改造成適合人類食用的作物。開始是通過無意識的人工選擇。上世紀產生的誘變育種和雜交育種技術讓我們能夠人為的改變作物的基因組。不過這種改變是隨機的，摻雜了很多不定因素。轉基因技術的誕生讓人類能夠更有效地使作物符合自己的需要。縱觀人類歷史，科學技術一再幫助我們提高了生活質量，延長了平均壽命。任何以“回歸自然”為借口而反對現代技術應用的行為都是反智的。正是因為無數代人努力地改造這自然中野生的物種，我們貨架上的食品才會越來越豐富，越來越可口，越來越健康，越來越安全。