PCR反應體系

設計PCR 引物時的一般原則

(1)引物長度- 一般15~ 30鹼基，過短則特異性低; 過長則會引起引物間的退火而影響有

效擴增。

(2) 避免內部二級結構，避免序列內有較長的迴文結構，使引物自身不能形成髮夾結構。

(3) G/C 和A/T 鹼基均勻分佈，G/C 含量在45%~ 55% 之間，引物鹼基序列儘可能選

擇鹼基隨機分佈，避免嘌呤、嘧啶的連續排列。

(4) 要避免兩個引物間特別是3' 末端DNA 序列互補以及同一引物自身3' 末端的序列互

補，使它們不能形成引物二聚體或發卡結構。

(5) 引物3' 端鹼基一般應與模板嚴格配對，並且3' 端為G、C 或T 時引發效率較高。

(6) 引物5' 端鹼基可不與模板匹配，可添加與模板無關的序列(如限制性內切酶的識別

位點、ATG 起始密碼子或啟動子序列等)。這些與原初模板並不配對的非互補序列在後續的循

不中將被帶到雙鏈DNA 中去，這樣反應產物不僅含有目的序列，同時在目的基因兩側又有了

的限制酶切位點，用相應的限制酶切割后即可將PCR 產物定向克隆到載體中。