TaqDNA聚合酶

Taq DNA聚合酶是從一種水生棲熱菌（Thermusaquaticus）yT1株分離提取的。yT是一種嗜熱真細菌，能在70～75℃生長。該菌是1969年從美國黃石國家森林公園火山溫泉中分離的。該酶基因全長2496個鹼基，編碼832個氨基酸，酶蛋白分子為94KDa。其比活性為200000單位/mg。75～80℃時每個酶分子每秒鐘可延伸約150個核苷酸，70℃延伸率大於60個核苷酸/秒，55℃時為24個核苷酸/秒。溫度過高（90℃以上）或過低（22℃）都可影響Taq DNA聚合酶的活性，該酶雖然在90℃以上幾乎無DNA合成，但確有良好的熱穩定性，在PCR循環的高溫條件下仍能保持較高的活性。在92.5℃、95℃、97.5℃時，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分別經130min，40min和5～6min后，仍可保持50%的活性，實驗表明：PCR反應時變性溫度為95℃～20sec，50個循環后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性。Taq DNA聚合酶的熱穩定性是該酶用於PCR反應的前提條件，也是PCR反應能迅速發展和廣泛應用的原因。Taq DNA聚合酶還具有逆轉錄活性，其作用類似逆轉錄酶。此活性溫度一般為65～68℃，有Mn2+存在時，其逆轉錄活性更高。

TaqDNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，該酶的催化活性對Mg2+濃度非常敏感。以活性程度很低的鮭魚精子DNA為模板，dNTP的濃度為0.7～0.8mmol/L時，用不同濃度Mg2+進行PCR反應10min，測定結果為Mgcl2濃度在2.0mmol/L時該酶催化活性最高，此濃度能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性，Mg2+過高就抑制酶活性，當Mgcl2濃度在10mmol/L時可抑制40～50%的酶活性。由於Mg2+能與dNTP結合而影響PCR反應液中遊離 的Mg2+濃度，因而Mgcl2的濃度在不同的反應體系中應適當調整，優化濃度。一般反應中Mg2+濃度至少應比dNTP總濃度高0.5～1.0mmol/L。適當濃度的KCL能使Taq DNA聚合酶的催化活性提高50～60%，其最適濃度為50mmol/L，高於75mmol/L時明顯抑制該酶的活性。

相對分子質量為94的Taq DNA聚合酶的活性較高，大約為200000 U/mg，在合成DNA時有一個較高的最適溫度75～80℃。Taq DNA聚合酶雖然在90℃以上合成DNA的能力有限，但高溫時仍比較穩定。有實驗證明，在92.5℃、95℃和97.5℃時，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分別經130min、40min和5～6min后，仍可保持50%左右的活性，其半衰期較長。所以，在一個PCR預備試驗中，每次循環時上限溫度為95℃處理20S，則循環50次后Taq DNA聚合酶仍可保持65%的活性，能夠保證實驗的需要。

Taq DNA聚合酶具有很高的加工合成特性，在最適反應溫度時，dNTP的摻入速度為35～100nt/（s．酶分子），最長擴增長度可達7.6kb。在低溫條件下，Taq DNA聚合酶的活性明顯降低，導致此酶在模板內局部二級結構區域的延伸能力受阻或前進速率常數與解離常數的比值發生改變。在較高的溫度（95℃以上）時，很少有DNA合成；在體外，DNA在較高溫度時的合成速度受到引物或引物鏈與模板鏈雙鏈結構穩定性的限制。

由於Taq DNA聚合酶的最適反應溫度高達75～80℃，故退火溫度和延伸溫度均可適當提高，這限制了非特異性擴增產物的出現，增加了PCR反應的特異性。

Taq DNA聚合酶的氨基酸順序，特別是氨基酸的前1/3區域，與大腸桿菌聚合酶I非常相似，因而它們屬於一種多功能酶。

1．具有5'→3'聚合作用

可以以DNA為模板，以結合在特定DNA模板上的引物為出發點，將四種脫氧核苷酸以Watson—Crick配對的方式按5'→3'方向沿模板順序合成新的DNA鏈。

2．具有5’→3'核酸外切酶活性

Taq DNA聚合酶具有依賴於DNA合成作用的鏈置換的5’→3’核酸外切酶活性，無論單鏈DNA還是退火到M13模板上，5’端P標記的寡核苷酸均不降解。另外，如果模板上有一段退火的3’磷酸化的阻斷物會被逐個切換而不會阻止來自上游引物鏈的延伸，即它並不抑制在3'一OH末端上游引物的摻入。

（一）溫度：雖然Taq DNA良合酶有很強的溫度適應範圍，但高於60℃的環境仍會使部分酶變性失活。反之，如果溫度低於正常值，酶活性受到限制。而且由於引物在低溫下（特別是25—27℃）可能與基因組中別的部分同源釣序列結合，使得一些擴增產物並非為目的序列。適當提高溫度，錯配鹼基多會解離，反應產物特異性增加。Taq DNA聚合酶的最適應溫度以70℃為宜。

（二）鎂離子濃度：TaqDNA聚合酶活性對Mg的濃度非常敏感。TaqDNA聚合酶和許多其他聚合酶一樣，是Mg依賴性酶。用鮭魚精DNA作模板，dNTP的總濃度為0.9~0.8mmol/L，用含不同濃潑MgCl2的PCR系統使反應進行10分鐘。測定結果表明：在MgCl2為2.0mmol/L條件下，酶活性顯示性高。Mg濃度偏高，酶活性會受到限制，10mmol/LMgCl2使酶活性抑制約50%。由於Mg可以與負離子或負離子團（如磷酸根）結合，而在PCR中，DNA模板、引物以及dNTP是磷酸根的主要來源，其中dNTP佔有很大比例。因此反應系統中，Mg的最適濃度還要受到dNTP濃度的影響，欲獲得最佳反應結果，要對反應條件進行必要的探索。每當一個新的目的片段和引物第一次使用時，或者某種參數（dNTP或引物濃度）改變時，應進行Mg2+的最適濃度滴定。一個普遍的原則是，樣品中Mg的最終濃度至少要比dNTP總濃度高0.5~1.0mmol/L。

（三）KCl的最適濃度：一般是50mmol/L，高於75mmol/L時，聚鏈反應就受到明顯的限制。當KCl濃度高達200mmol/L以上時，聚鏈反應就受到明顯的限制，此時反應進行10分鐘仍無核苷摻入．濃度均為50mmol/L的NH4ClNH4Ac以及NaCl對TaqDNA聚合酶活性影響則分別為中等抑制、無影響以及25~30%促進。

（四）dNTP的濃度：均衡的低濃度dNTP更有利於酶活性的發揮，並能減少錯配，獲得多量的特異性強的DNA反應產物。各種核苷酸濃度為40umol/L的100ulPCR系統可以得到2.6ugDNA產物，而只消耗所提供核苷酸的半量。

（五）幾種變性劑對酶活性的影響：10%乙醇尚不抑制酶活性；二甲基亞碸（DMSO），二甲替甲醯胺（DMF）。甲醯胺在低濃度時對酶活性無影響，隨著它們濃度的提高，酶活性明顯下降。l0%DMSO會使酶活性減半。然而另有研究者觀察到，在某些聚鏈反應系統中，10%DMSO起著有利作用。這種結構各異的現象還表現在用尿素進行的實驗中。1.0mol/L尿素能提高酶活性，2.0mol/L尿素能保存大部分酶活性。然而也有報告認為0.5mol/L尿素則完全抑制PCR。總之，變性劑對TaqDNA聚合酶以及PCR系統的影響參數有待更多的實驗數據。TaqDNA聚合酶對SDS十分敏感，而某些非離子型去污劑又能完全消除低濃度SDS對酶活性的抑制效應。例如，0.5%Twen20及0.5%NP40可抵消0.01%SDS對酶活性的影響。

該酶無校對活性，易產生錯配鹼基。

TaqDNA聚合酶的種類

a、保真性的一個通用標準是錯配率，錯配率越低保真性越好。普通Taq酶的錯配率在10-5鹼基/循環數，而高保真 Taq酶錯配率可降到10-6數量級，大大降低了出錯的可能性；它適合對PCR保真性要求較高的實驗，如基因篩選、測序、突變檢測等等。高保真aq酶的保真原理是：高保真Taq酶具有3‘到5’核酸外切酶的活性。市面上主要有兩類產品：一類是混合型的高保真酶，將帶有Proofreading活性的酶與普通Taq酶（用於提高擴增效率）混合起來；另一類是單一型的高保真酶。

b、熱啟動Taq酶（高特異Taq酶）：在PCR第一個循環變性之前，有一個升溫的過程，引物和模板會有一些非特異性配對，如果這時Taq酶發揮活性，就很容易產生非特異性擴增，由於循環初期模板量非常少，產生的非特異性條帶經過後面的指數擴增，就會嚴重干擾目的片段的擴增，甚至導致特異性條帶不能擴出；而熱啟動Taq酶是必需經過高溫才能激活的酶，因此在初始循環的變性之前它沒有活性，不會產生非特異性擴增，這就大大提高了PCR擴增的特異性。

c、高耐熱Taq酶：對於有些模板變性溫度較高，需要時間較長，可能要求高耐熱性Taq酶，如NEB公司的Vent和Deep Vent DNA聚合酶系列，兩者都是從海底火山口分離出來后克隆的，是普通Taq酶耐熱性的三倍以上，前者在95°C半衰期近7小時，100°C近2小時；而後者分別為23小時和8小時。

d、超長片段擴增Taq酶：對於做基因組圖譜、測序及分子遺傳學研究的科研人員，可能會用到超長片段的擴增，Clontech公司的Advantage Genomic系列混有Tth DNA聚合酶，Proofreading酶和熱啟動抗體，對複雜模板可擴增10kb片段，簡單模板可達40kb。

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