角蛋白酶

角蛋白酶（keratinase）是一種誘導酶，只有當環境中出現誘導子(角蛋白)時才會合成。

早在19世紀初人們就發現一些生物能降解角蛋白，自那時以來分離此類菌株的工作一直在進行。目前發現可降解角蛋白的微生物已有30多種，其中有細菌、放線菌和真菌。細菌中主要是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，放線菌中主要是高溫單胞菌屬(Thermmonospora)和鏈黴菌(Streptomyces)，真菌中主要是白色假絲酵母和一些皮膚真菌。不同微生物產生的角蛋白酶具有一定的差異，主要表現在酶的存在方式以及酶的結構、組成、穩定性、最適反應溫度、pH值等方面。例如角蛋白酶的存在形式，有的主要存在於胞內，有的主要分泌至胞外，而黴菌的角蛋白酶既可見於胞內又可分泌至胞外。

目前已發現30餘種微生物可分泌角蛋白酶，這些微生物主要來自於真菌、放線菌和細菌，如真菌中的皮膚癬菌（Dermatophyte）和白色假絲酵母（Cnadina albicans），放線菌中的鏈黴菌（Streptomyces），細菌中的地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等等。

真菌是最早被發現的能夠產角蛋白酶的微生物。早在1899年，Ward就報道了Onygena equina（馬爪甲團囊菌）能分解角蛋白。許多皮膚真菌類的微生物都有產角蛋白酶的功能，包括須癬毛癬菌（Trichophyton mentagrophytes）、微孢長囊頭孢黴菌（Doratomyces microsporus）、紅色毛癬菌（Trichophyton rubrum）、雞禽毛癬菌（Poultries Trichophyton）、石膏樣小孢子菌（Microsporum gypseum）、犬小孢子菌（Microsporum canis）和白念珠菌（Monilia albicans）、黃麴黴（Aspergillus flavus）、熱帶念珠菌（Oidium tropioale）、近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）、克柔念珠菌（Candida krusei）等。皮膚真菌附著於皮膚后，首先會利用角蛋白酶將皮膚的角質降解，降解后產生了各種短肽和氨基酸，作為真菌生長的碳源和氮源。然後進一步侵入皮膚進行繁殖、感染，進而形成皮膚病。目前，一些有關致病真菌的研究已經日益展開，同時對角蛋白的降解機理和相關研究也起到了積極的作用。

除皮膚真菌外，還有一些其他真菌具有降解角蛋白的功能。Anbu等（2004）發現了一種產角蛋白酶的能力的短尾帚霉（Scopulariopsis brevicaulis），並對這種角蛋白酶進行分離純化。Singh等研究了21種產角蛋白酶的真菌，發現其中猴髮癬菌（Trichophyton simii）降解羽毛角蛋白的能力最強。羅文等從土壤中分離出一株能降解羽毛粉角蛋白的黴菌，初步鑒定為串孢屬菌（Catenularia sp.）。Santos報道了分離到降解羽毛角蛋白的煙麴黴（Aspergillus fumigatus），它可以利用羽毛角蛋白作為唯一碳源和氮源生長。

產角蛋白酶的放線菌以鏈黴菌為主要代表，如弗氏鏈黴菌（Streptomyces fradia）、黃白鏈黴菌（Streptomyces alboflavus）K1-02、鏈黴菌（Streptomyces）DSM 40530和嗜熱鏈黴菌（Streptomyces thermophilus）等。丁正民等（1993）從雞毛堆肥中分離純化到一放線菌菌株SS-1，該菌有很強的降解雞毛的能力。塗國全等（1994）篩選出了角蛋白分解菌株S22-1，該菌能迅速分解羽毛、人發等多種角蛋白。根據該菌的培養特性、形態特徵、生理生化特性的測定結果與已知的弗氏鏈黴菌形態特徵、生理生化特性相似，但在培養特性和分解利用羽毛角蛋白的特性上有較大差異，因此被初步鑒定為弗氏鏈黴菌的一個變種。

目前已經篩選和分離到很多能降解角蛋白的細菌，主要為芽孢桿菌。Williamsh等（1989）由家禽羽毛髮酵液中富集、分離到了羽毛分解菌，經鑒定為嗜熱型地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），這種菌在以羽毛作為其主要的碳氮源的培養基條件下生長最適宜，但不能降解未經高溫蒸煮的羽毛。其他芽孢桿菌包括嗜鹼芽孢桿菌（Bacillus pseudofirmus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）等。另外具有角蛋白酶活性的細菌還有嗜熱厭氧菌、弧菌科細菌（Vibrionaceae）、海島閃光桿菌、金黃桿菌屬等。

細菌生長快、易於繁殖、產酶活性高，角蛋白酶最適溫度、pH值等性質特異，具有良好的應用潛力。

目前已分離純化的角蛋白酶的分子量差異較大，從十幾kDa到幾百kDa不等。較小的為單體酶，有報道來自Nesternkonia spAL-20的角蛋白酶，分子量為18kDa，較大的為複合酶，如嗜熱厭氧菌產的角蛋白酶可達200kDa以上。大部分角蛋白酶的分子量集中在30～70kDa之間，如HSIN-HUNG LIN報道的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）產的角蛋白酶大小為30kDa，嗜麥芽黃單胞菌（Xanthomonas maltophilia）產的角蛋白酶大小為36kDa，近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）的角蛋白酶為60kDa。枯草芽孢桿菌產角蛋白酶的分子量為60kDa 。

角蛋白酶作用的底物除了角蛋白外，它還可水解多種蛋白質底物，包括可溶和不可溶的蛋白質。角蛋白酶可以降解如酪蛋白、明膠、牛血清白蛋白等可溶的蛋白質。也可以降解包括羽毛、羊毛、角質、人發、指甲等不可溶的蛋白質。個別角蛋白酶的底物範圍很窄，例如雞毛癬菌角蛋白酶只能降解鳥類羽毛，較難降解其它種類的角蛋白。

角蛋白酶的最適反應pH以中性到鹼性居多，一般為7到10之間。個別角蛋白酶最適pH可達到12左右。酸性角蛋白酶比較少，大都為某些真菌，如鬚毛蘚菌產的角蛋白酶最適pH為5.5，白色假絲酵母為4.0。

角蛋白酶的最適反應溫度一般在40℃～60℃，如Microbacterium的最適溫度在55℃，也有溫度要求較低或較高的角蛋白酶類，如Stenotrophomonas sp. D1.為20℃，而Fervidobacterium islandicum AW-1的膜結合角蛋白酶的最適溫度高達100℃。

角蛋白不溶性於水及大部分有機溶劑，使得角蛋白酶活性測定比一般蛋白酶困難。常用測定角蛋白酶的原理是以底物水解后釋放的氨基酸的量來確定角蛋白酶的活性。目前測定角蛋白酶的方法主要有三種，一種是直接用角蛋白粉作為底物進行測定，塗國全等（1998）曾以羽毛粉作為測定角蛋白酶的底物。第二種是使用經過修飾的底物進行酶活測定，該方法中作為底物使用的角蛋白被連接上生色基團，通過測定底物水解後放出的生色物質的含量可以判斷酶的活性。具有代表性的兩種底物是偶氮角蛋白和天青角蛋白，前者將偶氮連接於羽毛角蛋白上的自由氨基酸殘基，後者為羊毛角蛋白與三甲基硫堇結合的產物。第三種則是以可溶性的羽毛角蛋白作為底物表徵角蛋白酶的活性，該方法由Wawrzkiewicz提出並被廣泛採用。它是利用二甲基亞碸溶解羽毛角蛋白，再用異丙醇經行沉澱，乾燥后的可溶性角蛋白溶解於相應的緩衝液中作為底物。

微生物降解角蛋白的機理各不相同，因此降解過程中的產物也不盡相同。某些真菌還原雙硫鍵是通過菌絲體表面所分泌的亞硫酸鹽及其產生的酸性環境；鏈黴菌則是通過產生胞內還原酶 然而，不溶於水的角蛋白只能以顆粒的形式存在於胞外。因此，雙硫鍵的還原只能發生在代謝能力強的整體細胞外面，最有可能發生在細胞表面的胞聯氧化還原系統(cell—bound redox system)中，它需要不溶的角蛋白與細胞緊密接觸。對純白高溫放線菌的觀察發現，雙硫鍵還原是通過胞聯氧化還原系統進行的。在弗氏鏈黴菌和地衣芽孢桿菌的角蛋白酶解時，沒有檢出釋放的巰基，這可能是由於胱氨酸雙硫鍵還原產生的半胱氨酸(一SH)很快被轉化成了其它產物。

角蛋白酶實際上具有二硫鍵還原酶和多肽水解酶的活性。目前普遍認為角蛋白酶的降解過程分3個步驟，即變性作用、水解作用和轉氨基作用。首先二硫鍵還原酶作用於角蛋白二硫鍵，將胱氨酸(一S—S一)還原為半胱氨酸(一SH)，使角蛋白高級結構解體而形成變性角蛋白；變性角蛋白在多肽水解酶作用下逐漸水解成多肽、寡肽和遊離氨基酸；最後由轉氨基作用產生氨氣和硫化物而使角蛋白徹底水解。角蛋白中硫主要轉化成巰基化合物，硫化氫(HzS)和硫酸鹽3種含硫化合物形式存在於分解產物中。通過進一步探索3種含硫化合物的形成過程表明。”，巰基化合物是由角蛋白酶中二硫鍵還原酶裂解角蛋白中的二硫鍵而形成的；硫化氫是由含巰基化合物或巰基氨基酸(半胱氨酸)在脫氫氧化酶作用下，脫氫、脫氨基而形硫化氫(H2S)；硫酸鹽的形成分別是由H2S或巰基化合物中硫通過氧化酶逐步氧化的結果。

微生物中純化的角蛋白酶活性很強，可以水解多種難降解的纖維蛋白類，如膠原蛋白、彈性蛋白和角蛋白。因此角蛋白酶具有廣泛的應用前景。

1、在農業上，微生物產生的角蛋白酶能使角蛋白降解為多肽和氨基酸，可以用於製造有機肥料，這種有機肥料不僅解決了國內能源緊缺的難題，還降解了污染源，大大改善了環境。在這方面，對於農業資源和畜牧業資源緊缺的中國來說，無疑是一個巨大的資源寶庫。

2、在飼料產業中，羽毛等的主要成分是角蛋白，其粗蛋白成分在80%以上，動物必需氨基酸種類齊全，同時含有較多大量元素、微量元素和未知生長因子，是一種良好的、可替代或部分替代魚粉的飼料蛋白來源。我國平均每年產羽毛達數10萬噸，絕大部分未得到合理利用。因此，對廢棄羽毛的開發、利用具有重要的應用前景，它一方面解決了當前飼料工業中蛋白資源不足的問題，另一方面又可解決環境污染問題。

3、角蛋白酶還可用於化妝品、工業生產及醫藥方面。在當今生物處理日益受到關注的形勢下，開發有發展潛力的角蛋白降解酶以實現角蛋白的高效生物降解已成為大勢所趨。角蛋白酶是皮膚真菌重要的侵襲因子，因此，能否利用角蛋白酶抑製劑或者角蛋白酶單克隆抗體抑制角蛋白酶的作用，削弱皮膚真菌的侵襲性，從而達到治療皮膚真菌感染的目的，是今後研究角蛋白酶與皮膚真菌感染相互關係的一個重要方向。角蛋白酶具有高效的角蛋白水解活性，利用角蛋白酶改善藥物在角蛋白中的通透性，可提高皮膚外用藥物的療效。特別是在銀屑病、角化過度性皮膚病( 神經性皮炎、慢性濕疹等) 的治療應用方面非常值得研究。

角蛋白酶也可應用於美容護膚品，幫助活性因子透過皮膚屏障，去除皮膚多餘角質，實現皮膚的深層護理。角蛋白酶能水解毛髮角蛋白，利用角蛋白酶進行脫毛，治療多毛症也可能具有良好的應用前景。

角蛋白的微生物降解與利用的重大意義，越來越引起了人們的廣泛興趣。然而目前，人們對角蛋白酶的認識還較膚淺。

國外一些學者的研究工作，已涉及角蛋白酶高級結構、活性表達分子基礎以及酶工程等分子生物學上的研究，主要集中在地衣形芽孢桿菌的角蛋白酶基因，已測出其編碼序列。而國內對角蛋白酶的研究還基本停留在產角蛋白酶菌的分離、篩選、角蛋白酶的分離純化及理化性質的研究，以及角蛋白酶的作用機制的初步研究。而且，研究的對象也極其有限，主要集中於對弗氏鏈黴菌的研究。而且以胞外酶的研究為主，對胞內酶的發表研究甚少，這主要是因為國內在角蛋白酶的分離提純上技術上的不完善。而且，豐富毛資源利用率低，在改善透皮藥物吸收方面的研究成果欠缺等問題亦急待解決。