重摺疊

【分類】有些蛋白，尤其是小分子的肽類，很容易復性，例如高表達干擾素、腫瘤壞死因子等用強變性劑鹽酸胍破菌溶解，稀釋後去除變性劑，就能表現出良好活性。而大分子蛋白以及二硫鍵較多的分子，重摺疊就較困難，有的根本就難以復性。例如高表達的Era蛋白，用尿素溶解后，在其底物GDP(鳥苷二磷酸)存在下，極緩慢地降低尿素濃度，最後去除尿素，也只有半數Era可復性溶解。由此可見蛋白質的復性或重摺疊是一個十分複雜的過程，而它又是應用生化工程技術的關鍵，所以有許多學者對多肽鏈是如何摺疊形成具有生物活性蛋白質的過程進行了艱苦的研究。

【重摺疊途徑】蛋白質摺疊的熱力學和動力學控制用熱力學和動力學分析的方法，對重摺疊途徑的步驟進行研究，其目的在於“活化”宿主微生物系統表達的無活性重組蛋白。為此先要闡釋或假設存在於蛋白質的初級結構，以初步確定摺疊途徑的摺疊密碼。如果能破譯摺疊密碼，就可以用DNA順序對蛋白質結構進行預測，並通過重組DNA技術對蛋白質結構進行分子改造，從而確定某一給定氨基酸順序的生物學功能。

①經典的“熱力學假說”——變性重摺疊過程中熱力學上的可逆性。

②變性一重摺疊過程中熱力學上的競爭性。隨著對蛋白摺疊研究的廣泛開展，發現許多蛋白質在體外的變性一重摺疊過程並非完全可逆

【重摺疊方法的選擇】

在絕大多數情況下．溶解變性的異源蛋向完全喪失了空間構象。如果異源蛋白在溶解變性過程中並不是100%的處於非摺疊狀態，或者還原型的蛋白質是可溶性的(如腫瘤壞死因子TNF)，則下游操作可簡單地包括離心、緩衝液交換、二硫鍵氧化，必要時進行層析純化。如果異源蛋白是完全變性的，則必須進行重摺疊操作，並儘可能避免部分摺疊中間產物形成不溶性集聚物。為達到此目的可採取下列方法：

(1)一步稀釋法

蛋白質集聚作用屬於多級動力學反應，嚴格依賴於蛋白質的濃度。在稀釋過程中，重摺疊與集聚作用的相互競爭可用數學模型關聯，而且重摺疊蛋向質的回收率可由兩個反應的速度常數推算。硅然，在重摺疊操作中，降低蛋白質濃度可以在很大程度上抑制集聚作用。例如，牛生長激素在重摺疊反應中的濃度為1．6 mg/mI。時，可以觀察到部分摺疊中間產物的形成，但在稀釋100倍后，摺疊中間產物便不會大量形成，這種濃度恰恰是牛生長激素體外摺疊的最佳條件。然而，重摺疊反應液高倍數的稀釋不僅增加了復性緩衝液的消耗成本，而且也為後續純化T序帶來了很大麻煩。應當指出的是。蛋白質性質不同，其最佳重摺疊所對應的蛋白濃度差別很大．有些蛋白質可在0．1～10 mg/mL的濃度內溶解完全，並足以進行有效摺疊。

(2)分段稀釋法

對於那些非摺疊和部分摺疊狀態不溶於水的蛋白質，往往採用分步稀釋的方法對之進行有效復性。變性蛋白在啟動體外復性和重摺疊時，不但變性劑的性質和濃度對摺疊率有很大影響，而且對其變化速度的掌握也至為重要，也就是說，變性劑的更換或稀釋速度快慢對重摺疊的影響因蛋I上I質而異。稀釋速度加快有利於重摺疊的典型例子是色氨酸酶，它在3 mol/L的尿素溶液中極易形成部分摺疊中間產物的集聚作用，因此從8 mol/L尿素的變性溶液透析至低濃度時，必須加快透析速度．使得色氨酸酶在3 mol/l，尿素溶液中的存在時間儘可能最短。反之．若將含有牛生長激素的2．8～5 mol/l。鹽酸胍溶液迅速稀釋到復性重摺疊所需的低濃度，會使產物大量的不可逆沉澱，但若將這個溶液先稀釋至2 mol/I。鹽酸胍濃度，並保溫一段時間，此時難溶性的摺疊中間產物逐步趨於溶解，在此基礎上進一步的稀釋則可獲得高產率的天然蛋向。應當特別指出的是，在上述分段稀釋法中，重摺疊蛋白的產率還與蛋白質濃度密切相關．所採用的稀釋倍數也受到緩衝液pH、離子組成及保溫溫度的顯著影響。與天然摺疊蛋白的等電點沉澱性質相似，在重摺疊過程中應當避免摺疊緩衝液的pH接近重組異源蛋白質的等電點pl。除此之外，還應注意選擇緩衝液的離子種類及使用濃度。由於陰離子對蛋白質疏水作用強度產生性質不同的影響，它們同時兼有穩定蛋白質摺疊結構以及誘導摺疊蛋白集聚的雙重功能。各種陰離子的作用強度次序為：Soj一>HPo；>Ac>Ci”>C12>N03一>T一：>Cl()1：>SCN(其中Ci=卜為檸檬酸根)，其中多價陰離子的雙重功能一般比單價陰離子要強。

(3)特種試劑添加法

在復性摺疊系統巾，某些特殊化合物的存在可以提高很多蛋白質的重摺疊率。例如，0．2mol/L的精氨酸可以明顯改善重組人尿激酶原(pro-UK)的活性回收率，同樣條件也適用於組織型血纖維蛋白溶酶原(t—PA)以及免疫球蛋白片段的體外重摺疊。0．1 mol/I．的甘氨酸能提高鬆弛肽激素的摺疊產率，而血紅素和鈣離子則能促進重組馬過氧化酶的重摺疊反應。另外，有些中性分子如甘油、蔗糖、聚乙二醇等，也能穩定蛋白質的天然構象，在某些情況下，將這些中性物質加入摺疊緩衝液中，可以改善蛋白質的體外重摺疊產率。

(4)蛋白化學修飾法

胰蛋白酶原的重摺疊很難用上述的緩衝液交換方法實現，然而在變性條件下，若將這個蛋白質的遊離巰基特異性保護，然後再將蛋白分子進行檸檬酸酐醯化修飾，則修飾后的胰蛋白酶原可溶於非變性的緩衝液中，從而促進重摺疊反應的順利進行。在上述修飾反應中所使用的酸酐活性試劑能可逆性地修飾多肽鏈上的遊離氨基，並將其正電荷轉換成負電荷，從而使蛋白質形成多聚陰離子狀態，後者通過分子問的斥力阻止集聚作用的發生。一旦修飾蛋白氧化並轉人非變性溶液中，將pH調低至5．0，即可通過脫醯基反應回收具有天然摺疊構象的蛋白產物。這一方法的效果已為後來的多次實驗所證實，特別適用於包涵體型重組蛋白的活性回收。蛋白質的化學修飾也可用於防止因二硫鍵錯配所產生的共價集聚作用。在變性溶解狀態下，將多肽鏈上的所有遊離巰基全部烷基化封閉，然後進行復性重摺疊操作，最終脫去烷基並在氧化條件下修復二硫鍵。

(5)重摺疊分子隔離法

蛋白質及其摺疊中間產物的集聚作用依賴於分子之間的碰撞與接觸，因此將非摺疊蛋白分子固定化，從理論上來說可以從根本上杜絕集聚作用的產生，實驗結果也證明這一思路的實用價值。例如，將非摺疊狀態的胰蛋白酶原固定在瓊脂糖球狀顆粒上，然後用一種復性緩衝液平衡層析柱，即可回收71%的酶活性。如果固定在層析介質上的蛋白質能方便地可逆性回收，那麼就可實現蛋白原位重摺疊，最終通過特定的解離溶劑從重摺疊層析柱上洗脫天然構象的活性蛋白產物。這項技術已被成功地用於包涵體型重組蛋白的重摺疊，只是精細的操作條件尤其是層析介質對蛋白質的親和性尚有待於逐一建立。