發光細菌

發光細菌 luminescent bacteria.luminousbacteria，進行生物發光的細菌。多數為海生，與發光浮游生物同能引起海面發光。此外，在空氣中，死魚及水產加工食品的表面於暗處也會發光，這種發光現象導致海生菌的第二次生長繁殖。用加有3%NaCl，1%甘油的普通肉汁蛋白腖培養基可以培養。發光菌形態雖多種多樣，但生理特性卻非常相似。一般對明膠不產生液化，分解蛋白質后不形成毒物，常寄生在各種動物體上引起“發光病”，即寄生髮光。這些細菌通常經由寄主的卵傳遞給後代寄主。有些發光魚類和烏賊是和發光細菌共生而利用了細菌的發光。明亮發光桿菌（Photobacterium phosphoreum）可在牛馬的死屍和肉中繁殖；它侵入人體則會產生髮光尿。這些細菌一般好低溫，最適溫度約為18℃，37℃以上則不發光。發光現象是酶促氧化反應，必需FM－NH2，O2長鏈飽和醛，蟲熒光素酶等。一般認為FMNH2就是熒光素。發光細菌有一百幾十種，除上述幾種外，典型的還有魚無色桿菌（Achromobac-ter fisheri）、磷光弧菌（Vibrio phosphoresce－ns）、發光桿菌（Bacillus photogenus）等。細菌發光的生物學意義與動物發光不同，還不十分清楚。根據具有可以抑制氯高鐵血紅素呼吸濃度的一氧化碳或氰化物，而不能抑制其氧化過程這點來看，可以把它看作是不參與細胞色素系統的呼吸形式稱為發光呼吸。發光細菌發出青白色光，如魚無色桿菌所發出的光，最大波長為490納米。

目前國內常用的3種發光細菌為：明亮發光桿菌、費氏弧菌、青海弧菌。

其中以明亮發光桿菌在 GB/T15441-1995 水質 急性毒性的測定 發光細菌法中所使用；

費氏弧菌在歐盟的標準中所使用；青海弧菌是在青海湖的魚體內提取的菌種，屬淡水菌，在測試飲用水時有較大優勢，並已申請凍乾粉製作專利：ZL 97106203.X

該檢測方法在5.12汶川地震災區有了較大規模的應用，快速、便捷、綜合評價等優點得到了充分發揮，受到了衛生、環保、疾控部門的重視，國家也將其列入應急監測項目。能夠提供此類設備的公司有北京濱松光子技術股份有限公司（國產技術）、荷蘭microLAN公司、美國SDI公司、以色列checklight公司等，詳細信息在其各自網站會有公布。

《發光細菌與環境毒性檢測》一書由朱文傑、鄭天凌、李偉民三位老師完成的作品，內容主要介紹了發光細菌的發現及應用領域等信息，著重介紹了青海弧菌的發展過程，大家感興趣的話可以進行查閱！

發光細菌是一類在正常的生理條件下能夠發射可見熒光的細菌，這種可見熒光波長在450-490nm之間，在黑暗處肉眼可見。全世界已命名的發光細菌有以下幾種：① 屬於異短桿菌屬（Xenorhabdus）的有發光異短桿菌（Xenorhabdus luminescens）；② 屬於發光桿菌屬（Photobacterium）的有明亮發光桿菌（Photosbacterium phosphoreum）和鰒發光桿菌（P．1eiognathi）；③ 屬於希瓦氏菌屬（Shewanella）的有羽田希瓦氏菌（Shezoanella hanedai），以前也曾經把它歸類為交替單胞菌屬（Alteromonas）的海氏交替單胞菌（Alteromonas hanedia）；④ 屬於弧菌屬（Vibrio）的有哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、美麗弧菌生物型I(V．splendidus biotype I）、費氏弧菌（V．fischeri）、火神弧菌（V．1ogei）和東方弧菌（V．orientalis）。霍亂弧菌（V．cholerae）和地中海弧菌（V．mediterranei）中的某些菌株有發光現象，曾有報道易北河弧菌（V．albensis）有發光現象，后將其重新分類歸人霍亂弧菌（V．cholerae）。另外，中國學者分離到一株淡水發光細菌命名為青海弧菌（V. qinhaiensis），還沒收入伯傑氏細菌手冊。

在以上發光細菌中，異短桿菌和青海弧菌屬於淡水發光細菌，其它都是海洋細菌。發光細菌主要分佈於海洋環境中。

發光機理的研究表明，不同種類的發光細菌的發光機理是相同的，是由特異性的熒光酶（LE）、還原性的黃素（FMNH2）、八碳以上長鏈脂肪醛（RCHO）、氧分子（02）所參與的複雜反應，大致歷程如下：

FM NH2+LE → FMNH2·LE+ O2 → LE·FM NH2·O2

+ RCH O →LE·FMNH2·O2·RCH0 → LE+ FM N +H2O+RCOOH+光

概括的說就是，細菌生物發光反應是由分子氧作用，胞內熒光酶催化，將還原態的黃素單核苷酸（FMNH2）及長鏈脂肪醛氧化為FMN 及長鏈脂肪酸氧化，同時釋放出最大發光強度在波長為450-490nm處的藍綠光。其中三步反應產生三種中間產物，壽命極短，很難分離出來。

熒光素酶是生物體內催化熒光素或脂肪醛氧化發光的一類酶的總稱，細菌熒光素酶是含α、β兩個多肽亞基的單加氧酶，只有兩個亞基共存時才有活性。從不同海洋細菌中提取到的細菌熒光素酶其分子量差別較小。王安平等分離純化了東方弧菌的熒光酶並對其酶學性質進行了研究，分離得到了兩個分子量分別為44 kD和41 kD的亞基，該酶反應的最佳溫度在l8℃ ，超過25℃酶即迅速失活。

環境監測

發光細菌由於其獨特的生理特性，在環境監測中被作為測定環境中毒物的指標。發光細菌在正常的生理條件下能發出波長在450～490nm 的藍綠色可見光，在一定的試驗條件下發光強度是恆定的。與外來受試物接觸后，由於毒物具有抑制發光的作用，發光細菌的發光強度即有所改變，變化的程度與受試物的濃度在一定範圍內呈相關關係，同時與該物質的毒性大小有關。外來受試物主要通過下面兩個途徑抑制細菌發光：① 直接抑制參與發光反應的酶類活性；②抑制細胞內與發光反應有關的代謝過程。凡能夠干擾或破壞發光細菌呼吸、生長、新陳代謝等生理過程的任何有毒物質都可以根據發光強度的變化來測定。利用發光細菌來檢測有毒物質，由於有毒物質僅干擾發光細菌的發光系統，發光強度的變化可以用發光光度計測出，費時較少且靈敏度高，操作簡便，結果準確，所以利用發光細菌的發光強度作為指標來監測有毒物質，在國內外越來越受到重視，在環境監測中的應用也越來越廣泛。

利用發光細菌毒性試驗檢測環境污染物急性毒性備受重視，中國於1995年將這一方法列為環境毒性檢測的標準方法（GB/T15441—1995）。相信這一技術會在中國的環保事業中發揮更大的作用。

利用發光細菌製作生物感測器，是人們研究的熱點之一。發光細菌的發光強度與某些污染物的濃度呈較好的線性關係，能夠穩定、靈敏、快速地反映環境中污染物的濃度變化，因此，利用發光細菌製備識別元件，成為國內外感測器研究和發展的熱點。20世紀80年代初美國Beckman公司推出功能完備的生物毒性測試儀，它具有應用範圍廣，靈敏度高，相關性好，反應速度快等優點，發光細菌毒性測試（Luminescent bacteria toxicitytest，L．B．T．）技術在世界範圍內迅速推廣。細菌能夠穩定、高效、持續發光是其被用做生物敏感材料來製備識別元件的基礎，因此篩選優良的菌種是感測器製作的關鍵之一。海洋發光細菌是海洋環境中的正常微生物，從海洋環境中分離優良的發光細菌菌株是可行的。

基因組成

發光基因（lux gene）系統中包括結構基因luxC，D，A，B，E 和調節基因luxI和luxR 等。從不同發光細菌中分離得到的發光基因其種類和數量有所差異，例如luxF僅發現於明亮發光桿菌，但以上五個結構基因luxC，D，A，B，E 是普遍存在於已知的所有發光細菌中的。編碼菌熒光素酶的基因是luxA 和luxB，在lux操縱子中，luxA 和luxB 是緊密相連的。以哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）為例，其luxA 基因中含有1065bp，編碼的α亞基是355個氨基酸的多肽，分子量為40kD；luxB基因中含有972bp，編碼的β亞基是有324個氨基酸的多肽，分子量為36kD。由α、β兩亞基組成的熒光酶的分子量為76 kD。編碼脂肪酸還原酶(多肽轉移酶和還原酶）的luxC和luxD位於luxA、luxB基因的上游一側，編碼合成酶的luxE基因位於luxA，luxB基因的下游一側。luxC 含有1431bp，編碼的蛋白質含有477個氨基酸，分子量為55 kD；luxD 編碼的蛋白質分子量為33 kD；luxE編碼的蛋白質分子量為42 kD。在明亮發光桿菌中還發現有luxF基因，它通常位於luxB和luxE之間，其編碼的蛋白質分子量為26 kD 左右，但lux F基因在弧菌屬和異短桿菌屬中的發光基因系統中尚未被發現。在以上所有菌株的操縱子中，這些基因的順序都相同，均為lux CDAB(F)E。

在lux 系統中，結構基因上游有2個調節基因，它們是lux I和luxR。它們分別屬於兩個不同的操縱子之中，lux I在右面的操縱子中，右面的操縱子中還含有lux CDAB(F)E基因，lux I位於lux C 的上游。lux 系統的整個結構如下：luxR，lux DAB(F)E。lux I編碼的是發光細菌自誘導物（autoinducer）因子合成酶，luxR 編碼的是發光系統的調節蛋白。研究表明，luxI和luxR基因的表達產物都是lux 系統完整表達併產生髮光的調節物質，任何一個基因的有效突變都會改變lux系統的表達水平，甚至使發光細菌變為暗變種。

發光細菌所含的發光基因（lux gene）表達的直接結果是產生生物發光，非常直觀而且易於檢測，因而被廣泛應用於基因操作，作為標記（marker）基因和報告（reporter）基因來研究基因的轉導、表達和調控。另外，通過基因工程而產生的很多基因工程發光細菌的研究和應用也很有價值。完整的發光基因系統已經被成功地轉入其他細胞中，如原核細胞、真核細胞和哺乳動物細胞。lux基因可以作為一個很好的標記基因重組在質粒載體或其他載體上。若將發光基因系統中的結構基因放在一個被試的啟動子的下游，一併插入載體DNA中進行轉導實驗，可通過宿主細胞是否發光確定轉導是否成功，並通過宿主細胞的發光強度的高低來確定發光基因的轉錄表達水平和結構基因上游的啟動子的活性大小。另外，還可以用發光基因來研究終止子（terminator）的活性大小，以及研究其他細胞內的某些基因的表達與調控的規律。利用含有lux系統的具有感染力的載體（噬菌體）在感染宿主細胞時能產生生物發光的現象，可以研究其感染的過程和機理

基因工程發光細菌是指通過基因工程技術將lux系統導入其他非發光宿主細胞后，形成一類能夠發光的細菌。利用基因工程發光細菌可以快速測定化學物質及環境污染物的毒性，確定生物的存活能力，快速確定環境污染的程度以及進行環境質量的評價。還可以利用基因工程發光細菌進行細菌在土壤和水體中分佈的研究等。

lux 基因作為報告基因，用其構建基因工程微生物，通過對光線的檢測可以對微生物在環境中的生長、分佈、活性等進行實時在線監測。如利用發光酶基因標記的熒光假單胞菌檢測在小麥根圈的定植動態；跟蹤棉花根圈中的綠針假單胞菌；用發光酶基因標記巨大芽孢桿菌，獲得穩定發光的標記菌株，用於研究其在小麥根際的定殖動態和散布規律等。

某些細菌長期生活在含有某種化學物質的環境中，細菌基因組中含有對該物質具有特異性的誘導基因和降解基因，或具有對該物質的抗性基因。將這些基因與lux基因融合構成重組體，在特異的化學物質存在時產生誘導作用，啟動誘導基因並導致lux基因表達，而由重組體的發光與否就可得知某化學物質是否存在。研究者們利用細菌對汞的抗性是依賴於Hg 與merR（汞抗性基因的調節基因）基因產物的結合和表達激活的原理，構建了由merR基因和luxAB基因融合的質粒載體，建立了發光強度與汞含量的關係。該系統靈敏度高而且專一性很強，用這種方法可檢測出環境中納克級的汞。因此，利用這種物質依賴性的基因工程發光細菌在這種特異性物質的存在條件下高水平的表達出生物發光，且發光強度與該物質的劑量呈正相關的特點，可以檢測環境中該物質的存在量。已經構建了汞、砷、苯、萘等物質依賴性的基因工程發光菌，用於環境中此類物質的檢測。發光細菌經過各種理化方法誘變處理后失去發光的能力，成為暗變異株。在接觸致突變物后，暗變異株可恢復一定的發光能力（通常可使暗變異株的發光強度增加1000倍左右）。利用暗變異株恢複發光的現象，可對各種遺傳毒物進行篩選、檢測。此法與其他微生物學方法（如Ames試驗）相比有靈敏、簡便、快速、無需嚴格無菌操作等特點。已開發了“Mutatox”的檢測系統，這是繼發光細菌急性毒性檢測的“microtox”之後推出的又一項發光細菌檢測技術。

另外，將lux系統導人某種噬菌體的DNA中，利用噬菌體與其宿主菌之間嚴格的特異性，可以檢測宿主菌的分佈、數量以及活性，靈敏度高而且速度很快，為環境微生物檢測提供了一種靈敏有效的方法。

水污染問題日益嚴重，與此同時也開發出許多靈敏、有效的環境監測方法，這些方法可以劃分為兩類：分析技術和生物監測。其中分析技術常常用於廢水常規指標的測試，但不能反應水質綜合毒性的大小。傳統的生物監測以水蚤、藻類或魚類為受試對象，雖然能反映毒物對生物的直接影響，但是這些方法的最大缺點是實驗周期長，實驗過程比較繁瑣。針對傳統生物毒性檢測方法的不足，研究和開發新型生物毒性監測技術——發光細菌法。該方法以簡便的操作方式、測量結果一目了然，受到了科研單位和企業的青睞。

自1672年R．Boyle觀察到發光的菌體所發出的光易被化學物質抑制后，許多科學家相繼對細菌的發光效應進行了大量的研究。本世紀70年代至80年代初，國外科學家首次從海魚體表分離和篩選出對人體無害，對環境敏感的發光細菌，用於檢測水體生物毒性，現已成為一種簡單、快速的生物毒性檢測手段。80年代初我國引進了這項技術，並先後分離出海水型和淡水型（青海弧菌）的發光細菌，用以檢測環境污染物的急性生物毒性。

一般發光細菌長約1.5-3um（微米），寬度0.5-0.8um，因此肉眼根本看不到，要用顯微鏡放大至1千倍時方可以分辨它們的體形。而它們的發光，也要在特定的條件中才能看得見。青海弧菌是唯一的非致病型淡水發光菌，所以專利產品青海弧菌凍乾粉在運輸、使用過程中安全可靠，對廢棄的菌液也不用進行特殊處理，不會引起二次污染。

新的發光細菌的產生實際上多少源自一些“有關陰謀”的想法。幾年前，美國國防部高級研究計劃局要求研究人員提交一些在無須電子設備的前提下編碼機密信息的方法。當時，馬薩諸塞州梅德福市塔夫斯大學的化學家David Walt正在與之前的指導教師、哈佛大學的化學家George Whitesides合作。他們曾一起想出了一個辦法，向一根保險絲中添加多種金屬鹽，當被點亮時，保險絲會發出紅外光的脈衝序列，從而編碼一個信息。這讓他們尋思用其他途徑完成相同工作的可能性。於是兩人決定嘗試其他的方法――用細菌編碼他們的秘密。

新的方案用7個大腸桿菌菌落取代了保險絲，而每個菌落又被賦予了一個不同的熒光蛋白質基因。只有當這些基因被開啟從而使細菌合成蛋白質時才會發出熒光。而其顏色――包括黃色、綠色和紅色――變化則取決於哪種基因得到了表達。所有這些差別都能夠被肉眼清楚地識別。憑藉手中的多彩細菌菌落，研究人員隨後利用一對顏色不同的細菌創建了一個代碼。而7種顏色使得他們擁有了49種組合，從而能夠用來編碼26個不同的英文字母以及23個字母數字元號，例如“@”和“$”。他們用若干對有色細菌寫了幾排信息。為了“印刷”這些信息，研究人員將細菌轉移到一個瓊脂板上，後者是一種細菌的生長介質，之後又壓上了一張硝化纖維“紙”，其目的是為了固定這些細菌。

此時此刻，硝化纖維紙中的細菌依然是看不見的。但是通過將硝化纖維紙壓入包含有化學觸發劑――能夠激活熒光蛋白的表達――的瓊脂板，信息的接收者便可以開啟關鍵的基因，並點亮各種顏色。（被選擇用來點亮的蛋白質通常不會被細菌所使用，所以除非被研究人員激活，它們通常保持靜默。）只要接收者知道哪種顏色相當於哪個字元，信息便被知曉了。但是Walt和他的同事還增加了一個額外的保障。他們在一些細菌中插入了對抗特定抗生素的基因；其想法是只有耐抗生素的細菌攜帶的才是真正的信息。如果這些信息落入到錯誤的手中，一旦基因被激活，接收者將會看到一片混亂的顏色而無法閱讀。但是如果接收者加入了正確的抗生素，不具抗性的細菌及其顏色便會消失，從而使真正的信息變得清晰起來。第一個例子便是在9月26日出版的美國《國家科學院院刊》中寫著的“this is a bioencoded message from the walt lab @ tufts university 2010”。

伊利諾伊大學厄巴納-香檳分校的化學家Kenneth Suslick表示：“這真是一個很酷的想法。”事實上，它與《螺旋》――由康奈爾大學物理學家Paul McEuen撰寫的一部科幻驚悚小說――的構思是如此相似。在書中，Liam Connor―― 一位上了年紀的真菌生物學家――通過向不同真菌的DNA中插入熒光蛋白質基因，從而解開了一個幾十年的神秘事件。雖然作為一個科幻小說迷，Walt表示想馬上讀到這本書，但他說之前並沒有聽說過它。如今藉助他的發光細菌，他也可以書寫一些關於自己的傳奇了。

發光細菌是短尾魷魚的生物時鐘。