病理技術

包括取材、固、脫、包埋、切片、染、封片步驟。

步驟技術協助病醫完。取材壞，影響切片質量。醫取材，首鋒取材刀，切割組織避免取材刀拖，切取組織塊厚薄均勻，般厚. ～.適，較容易脆組織甲狀腺、肝臟、血塊、淋巴結、大塊癌組織等可適當厚一點，而脂肪組織、肺組織、纖維性腫瘤、平滑肌瘤等緻密的或試劑不易滲入的組織應取薄一些；淋巴結應修掉兩側球冠，並盡量剔除周圍的脂肪組織。在取材中還應十分注意組織內是否有縫線或骨組織，如碰到不可避免的鈣化組織，應與技術室講明，在切取纖維組織、肌肉組織、胃腸道時，應注意纖維及肌肉的走向，取材時儘可能按與纖維平行走向切取為佳。

固技術室步，整製片程補救步。謂“固”，組織離，各辦細胞質盡量近狀態形態構 置程。固防止組織細胞溶腐敗，防止細胞酶蛋質，細胞各蛋質、脂肪、碳化合酶類轉溶質， 保持構仿。另，組織固，均呈硬化狀態，增組織韌，且易形，組織。組織旦離必需及固，固液量 組織倍。固鍵固及、固液選擇、固液濃、固溫。固液%福爾馬林。筆者認為，10%福爾馬林由於受到福 爾馬林的質量、使用時的揮發和取材時帶入的水分影響，濃度被降低致組織固定不足，而高濃度的福爾馬林，降低了對組織的穿透性，形成周圍固定好而中央固定不到的現象。通 過實踐，本人認為以酸性12～15%的福爾馬林最佳。大標本（2cm厚）一般需要6～12個小時，小標本一般需要3～6個小時；當室溫低18℃時，可在37℃以下的溫箱內加溫4～6個小時。由於HE染色最佳著色PH為3.5～4.5, 中性福爾馬林對蘇木素染色有一定影響，細胞核容易發灰，核染色質不佳。所以, 儘管中性福爾馬林對抗原有很好的保存作用，但酸性福爾馬林對絕大多數抗原來說也有很好的保存作用，所以在沒有特別處理的情況下常規HE用12～15%酸性福爾馬林也可 以（每100毫升12～15%福爾馬林液內加5毫升冰醋酸）。骨髓、結締組織固定以Bouin液為佳，經Bouin液固定后的組織必須流水沖洗4小時以上。有條件的單位可根據不同要求選用二種或二種以上的固定液；少數單位還可建立組織冷凍庫，以便適應各種特殊的處理要求。

固定后水洗（10～20分鐘），通常被很多人所忽視，而水洗不徹底，容易造成脫片和染色不鮮艷。對需做免疫組織化學的組織，更不應當忽視。福爾馬林不利於組織塊內抗原的保存。

所謂脫水就是利用脫水劑將組織內的水分置換出來，以利於有機溶劑的滲入，這一過程稱為脫水。脫水是否徹底，直接關係到組織是否能充分透明，而脫水過度（原因是組織 在純酒精內時間過久，發生組織質地發生變化）容易造成組織發脆。造成組織發脆的原因還有加溫（溫度超過35℃）、脫水劑內加有丙酮、浸蠟用的石蠟中二甲苯過多等等。一般 我們總認為組織發脆跟高濃度酒精有關，而忽視了與低濃度的酒精關係，其實低濃度的酒精具有強大的穿透力，比純酒精更容易滲透到組織塊內部使之脫水，組織如果在低濃度酒 精里充分脫水，在高濃度酒精里只需脫去從低濃度到高濃度之間的水份，因此，僅需短時間就可完成，如果這時不縮短純酒精的時間，便會引起組織發脆；如果脫水時加溫，使用丙酮，還可引起組織收縮，並影響免疫組織化學的標記。為了使石蠟浸入到組織塊內，必須經過一種既能與脫水劑混合，又能與石蠟相溶的媒介物質，這個過程稱透明。目前最好 的透明劑是二甲苯。很多人認為二甲苯極容易使組織發脆，這個觀點很片面，在常溫下，如果不是時間過長（超過24小時以上）二甲苯並不會引起組織過份發脆，相反會使某些組 織結構比較質韌的組織：比如子宮肌瘤等相當好切），但是當二甲苯溫度超過35℃以後，極易引起組織發脆。所以本人認為，大小標本最好分開脫水，一般情況下，大標本脫水時 間（室溫18℃）以80%酒精2小時、95%酒精（2道）各1個半小時至2小時、純酒精（3道）各1個半小時至2小時，二甲苯（2道）各30-60分鐘為宜；小標本脫水時間應相應縮短。脫水時間長短，與室溫高低有密切的相關。我們在實踐中發現，室溫在12～15℃時，可作為一個臨界溫度範圍。當室溫高於此溫度範圍時，組織容易脫水，可適當縮短脫水時間；而 室溫低於該溫度範圍時，應適當延長脫水時間（如能保證在一個恆定的溫度下最佳）。更換試劑，應以量為基礎，定量更換，不能等到切片不好時再去更換。否則，至少會有2～3 批組織切片不好。根據我科經驗，如試劑用量為500ml，每500個蠟塊更換一次為宜。

組織透明后，在熔化的石蠟內浸漬的過程稱為浸蠟。用其他浸透劑（如火棉膠、明膠等）滲入組織內部的過程可稱為浸透或透入。浸蠟溫度過高（超過60℃），在蠟內加入二 甲苯蠟或由於透明時帶進的二甲苯過多，都會導致組織發硬，還會使組織內的抗原受到破壞；所以作者主張浸蠟用的石蠟熔點在56℃（三道），第一道：石蠟30分鐘；第二道：石 蠟90分鐘；第三道：石蠟，90分鐘。浸蠟溫度控制在56～58℃左右。（第一道也可用硬脂酸石蠟1：3混合浸蠟，不僅可軟化組織，特別適用於比較韌、硬的組織，而且由於硬脂酸 是弱酸性的，對細胞核有媒染作用，核漿比鮮明，但容易脫片；同時對疏鬆組織容易散片）。有條件的可以每天打開第一道石蠟的蓋子，讓二甲苯揮發。浸蠟所用的石蠟如有雜質 儘可能過濾，以防附在組織上，造成切片刀刀口受損，或切片破碎和划痕增多。

用包埋劑來支持組織的過程，最常用的是石蠟包埋法，包埋的關鍵一是平整，二是方位。要求在包埋時，應採用鑷子輕壓組織塊拱起部份，使之平貼於底部，通常採用 組織的最大麵包埋。囊壁、管腔組織應豎直包埋。小塊多顆組織，應盡量放在一起，並保證在一個平面上。修去兩邊的余蠟（所謂的兩邊，指切片時與切片刀垂直的兩側）。包埋 時還應注意有無縫線，紙絮，如有一定要去除。胃黏膜活檢標本，不能按一般的規律取最大包埋面，應採取窄面豎起包埋。包埋的蠟更應過濾，留有雜質的石蠟，容易造成污染或 刀口受損。蠟的熔點應在56～58℃之間選擇，不提倡在冬天使用軟蠟。因為用軟蠟包埋的蠟塊，到了夏天，會粘在一起，不利於資料的保存，而且即使在冬天，用硬蠟包埋的蠟塊 也比用軟蠟包埋的蠟塊要好切。

用切片機將包埋有組織的蠟塊切成薄片。切片厚度一般為4－6微米，切片的要求是完整、薄、均勻。病理切片技術的精確度直接影響診斷的精確度。

切片的第一步必需粗切。粗切的厚度大約在50～100微米左右，質地較硬的組織或較小的組織應再薄一些，粗切致組織全部暴露后，才進行細切。細切至組織塊表面均勻一致，無白點后，再把切的蠟片放入溫水中。切片時要求用力均勻、柔和，搖速不易過快或過慢。過快會導致切片厚薄不均，機器磨損；過慢會使切片增厚。切片厚度一般為3～5微米。切片的要求是完整、薄、均勻。切下的片膜其大小形狀應與組織塊一致，切片的不完整，常會將重要病變遺漏，導致誤診、漏診。在切片放蠟塊時，應注意組織包埋的方向，組 織的層次，纖維、肌肉等的走嚮應與切片刀平行，較難切的部分應放在上面，如皮膚的表皮，腫塊的包膜，胃腸道的漿膜等，這樣可以減少組織的斷裂現象。操作切片機時應用力 均勻，避免用力過重。對脫鈣組織、骨髓，以及已知的鈣化組織，應選用固定的刀口，以減少其他部位出現缺口的可能性。在使用毛筆展片時要防止筆絲進入刀口，因為每切到一 根筆絲，就會增加一個缺口。切片厚度一般為4～6微米，有人認為：只要切片機刻度標著幾個微米，切出來的片子就是幾個微米。其實不然，當切片刀不鋒利，或切片時速度不勻，或切的較慢時，切的片子都會變厚，只有在切片刀十分鋒利、切片勻速的情況下，才能真正保證其厚度。下面是切片時碰到的問題的原因及可能處理的方法：(1)組織發脆：一般 是脫水、透明、浸蠟時間過長、溫度過高，並與組織本身質地也有關，在切片時，邊切邊用嘴向蠟片吹氣，可能會好些。(2)切片捲起，可能是刀不鋒利，或刀鋒在另一面，或刀角 度過大，切片太厚等等。(3)蠟片彎曲：可能是刀鋒不均，切片刀未磨直，切片刀與蠟塊不平行。(4) 透明、浸蠟時間過長、溫度過高，並與組織本身質地也有關(5)厚薄不均：可 能是刀、刀座及蠟塊未夾緊，組織太硬，或切片機主軸太向前，或切片機已磨損。(6)切片出現裂痕：可能是刀有缺口，石蠟內有雜質，組織內有鈣化、骨片或有線結, 也可能會有 棉紙纖維等。(7)切片不連片，切不下片，切片很厚，或者切片后蠟塊發白，內陷：組織脫水不佳。補救辦法：可先將蠟塊溶解，取出組織，放入加熱水浴的丙酮內（80℃），30～ 60分鐘，再進行透明浸蠟包埋切片，也許會好一點。

展片水溫應在42℃至47℃之間，這主要和包埋蠟的熔點有關，水溫過高，會引起組織細胞散開，水溫過低，切片皺摺無法攤平。包埋蠟中如有二甲苯，也會造成石蠟溶解現象。而用一次性刀片切的片子，一碰到熱水，片子上的皺摺就無法再展開，這有二個方法可以解決：第一、可以在切片時邊切邊向蠟片吹氣，這樣的片子就會非常平整，放到熱水裡就 會自然展開，比較方便快捷，但這樣的片子會略微厚一點；第二、在切完片子后，先把切片放在30%酒精水溶液中，讓酒精的張力自動把皺摺展開，然後再將切片移到熱水，這樣的 片子會較薄；如酒精濃度過高，容易引起切片破碎，出現裂隙，像脂肪之類細胞間粘附性較小的組織一碰到酒精就會散開，故不能用此法。最後撈片時玻片要乾淨，要選擇那些完整、無皺摺的切片，粘貼於玻片中1/3和下1/3的中間。

烤片，一般在60℃的溫箱內烤片0.5～1小時左右，溫度過高，會引起切片細胞收縮；時間太短(少於20分鐘)，容易造成脫片。脫蠟也相當重要，如果脫蠟不幹凈，切片不易著 色或著色不勻，所以，脫蠟用的二甲苯要經常更換，一般用3道二甲苯，每500ml液體，處理500張切片后更換一次為宜。當室溫低於18℃時，必須將切片從溫箱拿出后立即放入二甲

苯中脫蠟，或將二甲苯放入溫箱內預熱（37℃左右）脫蠟，最高不得超過60℃。然後經高濃度的酒精到低濃度的酒精洗去二甲苯，至水。

蘇木素染色時間要根據染料的新舊、溫度、切片的類型而定，一般為5－15分鐘。經水略洗后，用鹽酸酒精分化，分化程度必須用顯微鏡控制。分化水洗后，可用溫水或自來水 藍化，並充分水洗（流水沖洗5分鐘以上），以防鹽酸殘留導致切片褪色。我們不提倡使用鹼性溶液（釋氨水、肥皂水等）促藍，儘管藍化效果很好，但從實踐的結果來看，用鹼性 溶液促藍的切片不能長期保存，容易褪色。最後入伊紅復染（5－20秒）。HE染色的關鍵在於深淺適度，對比鮮明，一般有經驗的，肉眼就能判斷，但偶而也會出現失誤，所以用顯 微鏡控制是最保險的方法。其關鍵的步驟在於蘇木素染好后的分化及藍化過程，在藍化結束后，應在顯微鏡下觀察細胞核著色是否合適，核結構是否清晰，胞漿內是否有殘留的蘇 木素等等。染色理想的切片在顯微鏡下應是：細胞核與細胞漿應藍紅相映，鮮艷美麗；核漿對比明顯，核膜及核染色質顆粒清晰可見。

脫水和封片

切片脫水應從低濃度的酒精到高濃度的酒精，80%酒精1道，95%酒精2道，純酒精2道，（正丁醇1道），二甲苯2道。濃度低的酒精比濃度高的酒精更容易脫水，但也容易使伊紅退色，故脫水時間可短一點，每道3－5分鐘，純酒精每道10分鐘。為增加酒精與二甲苯的相融性，可在二甲苯前面增加一道正丁醇；石碳酸－二甲苯液也有此效，但用石碳酸時如 不洗凈，可引起切片退色，不利於切片久存，故不作推薦。切片經二甲苯透明后，用中性樹膠封固。為增加切片的透明度，防止細胞收縮、龜裂或切片出現黑色結晶樣小點。所以 我們規定切片必須濕封，不得用溫箱烤乾或電吹風吹乾后乾燥封片。在南方冬春、霉雨季節，封片時要防止口鼻呼出的氣體接觸到切片；在天氣較潮濕的日子裡，不宜一次將多張 切片取出待封，以免切片“還潮”，形成透明不佳，出現雲霧狀水珠。脫水劑的更換也應有一定的時間規定。一般是每500ml液體，處理500張切片后更換一次為宜。封片樹膠不能過 稀，封片時樹膠要均勻充滿蓋玻片且樹膠不及外溢為佳。要將組織全部覆蓋，也不能有氣泡。最後，粘貼標籤，標籤必須貼於玻片左側，編號書寫清楚，最好能列印。

為了顯示與確定組織或細胞中的正常結構或病理過程中出現的異常物質、病變及病原體等，需要分別選用相應的顯示這些成分的染色方法進行染色。包括：膠原纖維染色（Masson等）、網狀纖維染色、彈力纖維染色、肌肉組織染色（磷鎢酸蘇木素）、脂肪染色（蘇丹III）、糖原染色（PAS）、粘液染色（PAS）等。

細胞製片包括各種來源的樣本的製備，比如宮頸脫落細胞樣本、呼吸系統樣本、體腔液樣本、腦脊液脫落細胞樣本、消化道脫落細胞樣本等的製備；細胞固定；細胞染色等。

免疫組化是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的方法。免疫組化方法有直接法和間接法；按照標記物的種類可分為免疫熒光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。

通過從分子水平上完成DNA、RNA或蛋白質檢測，從而對疾病作出診斷的方法稱為分子診斷技術，常用的方法有基因診斷和腫瘤標誌物檢測。

1.基因診斷 用分子生物學的理論和技術，通過直接探查基因的存在狀態或缺陷，從基因結構、定位、複製、轉錄或翻譯水平分析基因的功能，從而對人體狀態與疾病作出診斷的方法。基因診斷不僅能對某些疾病作出確切的診斷，如確定某些遺傳病，也能確定基因與疾病有關聯的狀態，如對疾病的易感性、發病類型和階段的確定等。基因診斷的主要技術有核酸分子雜交（原位雜交、southern雜交、Northern雜交、斑點雜交等）、PCR和生物晶元技術。

2.腫瘤標誌物檢測 是指腫瘤細胞和組織由於相關基因或異常結構的相關基因的表達所產生的蛋白質和生物活性物質，在正常組織中不產生或產量甚微，而在腫瘤病人組織、體液和排泄物中可檢測到。此外，在病人機體中，由於腫瘤組織浸潤正常組織，引起機體免疫功能和代謝異常，產生一些生物活性物質和因子，雖然這些物質和因子特異性低，但與腫瘤發生和發展有關，也可用於腫瘤輔助診斷。腫瘤標誌物分別有：原位性腫瘤相關物質、異位性腫瘤相關物質、胎盤和胎兒性腫瘤相關物質、病毒性腫瘤相關物質，癌基因、抑癌基因及其產物等。腫瘤標誌物測定方法包括：生物化學法、免疫組化法、單克隆抗體法。

由於電鏡產生的電子束穿透能力很弱，必須把標本切成厚度小於0.1微米以下的薄片才能適用，這種薄片稱為超薄切片，切片的製作過程基本上和石蠟切片相似。組織從生物活體取下以後，如果不立即進行適當處理，會由於細胞內部各種酶的作用，出現細胞自溶現象，容易出現人為假象，此外，還可能由於組織乾燥脫水、微生物污染等使細胞的超微結構受破壞。因此標本取材時必須要做到快、小、冷、准等四大基本要求。電鏡分透射電鏡和掃描電鏡，兩者標本的製備各有不同。