蛋白質等電點

在等電點時，蛋白質分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零(即正負電荷相等)，此時蛋白質分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產生沉澱，所以蛋白質在等電點時，其溶解度最小，最易形成沉澱物。等電點時的許多物理性質如黏度、膨脹性、滲透壓等都變小，從而有利於懸浮液的過濾。在等電點外的所有其他pH值，依據蛋白質所帶凈電荷採用電泳和離子交換層析來分離和分離純化該蛋白質。

等電點沉澱主要應用於蛋白質等兩性電解質的分離提純，還可應用於大豆異黃酮的分離：用等電點沉澱法脫去蛋白質，可提高異黃酮製品的純度，異黃酮截留率為7.2%，蛋白質截留率為91.1%。

大豆蛋白質在pH4.5左右達到等電點，此時其溶解度最低形成沉澱，利用這個性質來提取大豆分離蛋白，使大豆分離蛋白從提取液中聚沉下來，與其他可溶性物質分離。大豆分離蛋白不是在所有酸性條件下都沉澱，只有在等電點附近才沉澱，當pH調太低時溶解度反而升高，到pH2.5時，已沉澱的蛋白質就會幾乎全部重新溶解，因此必須嚴格掌握酸沉所需的pH，才能有滿意的效果。在分離中，大量的含磷化合物的存在是影響蛋白質提取的較大因素，最好除去植酸，可用透析法，也可根據蛋白質和植酸的溶解度的差異性將其除去。

大豆分離蛋白的一般工藝是用50℃溫水萃取並離心，把豆渣用50℃溫水和NaOH調整pH9進行二次萃取，並離心分離把分離出的豆漿進行酸沉，同時攪拌（60r/min），加入2%消泡劑和溫水，加入適量亞硫酸鈉調pH7左右，進行高速攪拌（120r/min）並加入3.5%HCL調至pH4.5，此時蛋白質在等電點開始沉澱，並經過一系列的工藝凝乳分離、均質、中和、殺菌乾燥得成品。

●方法：平板等電聚焦

●原理：蛋白質分子在含有載體兩性電介質形成的連續而穩定的線性pH梯度中進行電泳。但不自是按照等電點不同被分離。

●儀器：Bio-Rad Model 111Mini IEF Cell

●樣品要求：

●液體：濃度>3mg/ml；體積>200ul；固體：質量>200ug

●樣品純度>90%；含鹽量<3 0mM；分子量：一般要求大於1000Da

●常見影響測試情況:

1、蛋白質純度不足

2、含鹽量過高

3、蛋白質分子量太小，導致無法固定染色

找出所有可解離基團，並註明它們各自的pKa→假定它們在極低的pH下都處於非解離狀態→逐步提高溶液的pH→可解離基團按照pKa從低到高的順序依次釋放出質子，即pKa越低的就越先釋放出質子→寫出所以可能的解離形式→找出凈電荷為0的形式→將凈電荷為0形式兩側的pKa相加除於2。

蛋白質 等電點

鮭精蛋白[salmine] 12.1

鯡精蛋白[clupeine] 12.1

鱘精蛋白[sturline] 11.71

胸腺組蛋白[thymohistone] 10.8

珠蛋白（人）[globin(human)] 7.5

卵白蛋白[ovalbuin] 4.71; 4.59

伴清蛋白[conal bumin] 6.8;7.1

血清白蛋白[serum albumin] 4.7-4.9

肌清蛋白[myoal bumin] 3.5

肌漿蛋白[myogen A] 6.3

β-乳球蛋白[β-lactoglobulin] 5.1-5.3

卵黃蛋白[livetin] 4.8-5.0

γ1—球蛋白（人）[γ1-globulin(human)] 5.8;6.6

γ2—球蛋白（人）[γ2-globulin(human)] 7.3;8.2

肌球蛋白A[myosin A] 5.2-5.5

原肌球蛋白[myosin A] 5.1

鐵傳遞蛋白[siderophilin] 5.9

胎球蛋白[fetuin] 3.4-3.5

血纖蛋白原[fibrinogen] 5.5-5.8

α-眼晶體蛋白[α-crystallin] 4.8

β-眼晶體蛋白[β-crystallin] 6

花生球蛋白[arachin] 5.1

伴花生球蛋白[conarrachin] 3.9

角蛋白類[keratins] 3.7-5.0

還原角蛋白[keratein] 4.6-4.7

膠原蛋白[collagen] 6.5-6.8

魚膠[ichthyocol] 4.8-5.2

白明膠[gelatin] 4.0-4.1

α-酪蛋白[α-casein] 4.0-4.1

β-酪蛋白[β-casein] 4.5

γ-酪蛋白[γ-casein] 5.8-6.0

α-卵清粘蛋白[α-ovomucoid] 3.83-4.41

α1-粘蛋白[α1-mucoprotein] 1.8-2.7

卵黃類粘蛋白[vitellomucoid] 5.5

尿促丄性腺激素[urinary gonadotropin] 3.2-3.3

溶菌酶[lyso zyme] 11.0-11.2

肌紅蛋白[myoglobin] 6.99

血紅蛋白（人）[hemoglobin(human)] 7.07

血紅蛋白（雞）[hemoglobin(hen)] 7.23

血紅蛋白（馬）[hemoglobin(horse)] 6.92

血藍蛋白[hemerythrin] 4.6-6.4

蚯蚓血紅蛋白[chlorocruorin] 5.6

血綠蛋白[chlorocruorin] 4.3-4.5

無脊椎血紅蛋白[erythrocruorins] 4.6-6.2細胞色素C[cytochrome C] 9.8-10.1

視紫質[rhodopsin] 4.47-4.57

促凝血酶原激酶[thromboplastin] 5.2

α1-脂蛋白[α1-lipoprotein] 5.5

β1-脂蛋白[β1-lipoprotein] 5.4

β-卵黃脂磷蛋白[β-lipovitellin] 5.9

蕪菁黃花病毒[turnip yellow vvirus] 3.75

牛痘病毒[vaccinia virus] 5.3

生長激素[somatotropin] 6.85

催乳激素[prolactin] 5.73

胰島素[insulin] 5.35

胃蛋白酶[pepsin] 1.0左右

糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶[chymotrypsin] 8.1

牛血清白蛋白[bovine serum albumin] 4.9

核糖核酸酶（牛胰）[ribonuclease或Rnase(bovine pancreas)] 7.8

甲狀腺球蛋白[thyroglobulin] 4.58

胸腺核組蛋白[thymonucleohistone] 4左右