自養微生物

硫細菌靠吸收H2S並將其氧化放能，鐵細菌將2價鐵氧化成3價鐵放能，硝化細菌氧化亞硝酸鹽

高中常見的化能自養一般就這幾個學習從合成氨廠周圍土壤或通氣良好的耕地土壤中採樣、富集培養、分離純化硝化細菌。

學習硅膠平板製備，了解培養硝化細菌的培養基製備和培養方法。

化能自養微生物由於它們在農業生產、能源開發、冶金、採礦等方面的實際應用及在產能代謝、分子遺傳等理論研究方面的重要性，日益受到人們重視，本次實驗以硝化細菌為代表，介紹化能自養微生物的分離與純化。

硝化細菌是化能自養菌類群中主要生理類群之一。包括亞硝化細菌和硝化細菌(或稱亞硝酸氧化細菌)兩個亞群。它們是需氧菌、利用無機物氧化過程獲得能量同化CO2，合成細胞物質。

除在土壤氮素養分轉化及自然界氮素循環起重要作用外，由硝化細菌組裝的亞硝酸微生物感測器，可快速檢測大氣和水中的亞硝酸濃度，在環境監測中發揮作用。培養硝化菌的溫度，因菌源而異，從中溫環境下分離的菌株，最適生長溫度為26—28℃，從高溫環境中分離的菌株，40℃時生長良好，該菌喜中性或微鹼性環境，傾向於團體表面上生長，在液體培養基中培養時，往往附著在培養液中碳酸鈣顆粒上，沉澱於瓶底，或沾附在瓶壁上，影響細菌的分散和分離。若採用硅膠平板自富集培養液中分離硝化細菌時，滴加菌懸液於平板前要用CO2通氣處理(防止菌沾附瓶壁、沉澱瓶底或吸附在碳酸鈣顆粒上)。

化能自養菌代時長，生長極其緩慢，而伴生的異養菌卻生長迅速，為使欲分離的生長劣勢化能自養菌轉化為生長優勢菌，均需經專門培養該菌的待定培養液中使之富集培養，並限制其他菌繁殖，然後從富集培養液中分離、純化。為避免異養菌或其他生理特性相似的自養菌污染，純化后的菌株，尚需進行純度檢查和菌種的鑒別。

(一)菌源

合成氨車間周圍和堆放合成氨場地周圍土樣。

(二)培養基

硝化細菌分離培養基、硝化細菌增殖培養基、檢查有否異養型微生物的培養基(肉膏蛋白腖酵母膏培養基(BPY)，麥芽汁培養基、馬鈴薯葡萄糖培養基)，參見附錄二。

(三)試劑

格里斯氏試劑(亞硝酸鹽試劑)、二苯胺硫酸試劑(硝酸鹽試劑)。

(四)其他物品

稀釋分離所用的無菌水、無菌培養皿、無菌移液管、無菌微口滴管、無菌玻璃塗棒等。

(一)採樣

按實驗6—1採集土樣，選合成氨車間和堆放合成氨場地周圍土樣。

(二)富集培養

稱取土樣1g。接入到盛有20m1硝化細菌增殖培養液的250ml錐形瓶中，28℃振蕩培養10-14d，每隔幾天在白瓷板上分別加2—3滴格里斯氏試劑及二苯胺硫酸試劑。然後用無菌滴管取出1滴增殖培養液的培養物加於上面兩試劑中．攪和均勻。檢查增殖培養液中NO2-的減少(溶液由紅色、粉紅色變為無色，機理見實驗7—3)和NO3-的形成(NO3-氧化二苯胺的特有反應，溶液由無色變為深藍色)。為淘汰伴生的異養細菌，富集培養10d后，用無菌微口滴管吸取1—2滴富集培養物接入新鮮的硝化細菌增殖培養液中，繼續振蕩培養，繼續監測NO2-的減少和NO3-的形成，在連續轉移的後期增殖培養液中．可通過不斷補加KNO2，增加硝化細菌數日，並有效地抑制伴生的異養型細菌生長。

(三)分離純化

取富集培養液，通CO2氣體30min，然後靜置30min。再通過下列三種方法分離純化。

(四)純度檢查

由於硝化細菌培養過程，常會有異養型細菌伴生，所以必須用多種有機營養培養基檢查培養物是否有異養型細菌污染。常用的有機營養培養基是：BPY培養基檢查異養型細菌，麥芽汁培養基檢查酵母菌，馬鈴薯葡萄糖培養基檢查黴菌。上述培養基平板或斜面接種培養物后若有菌生長，表明分離瓶中培養物不純；不生長，則為基本純的培養物。若有異養型微生物存在，需重新分離、純化。

(五)鏡檢

對分離純化的硝化細菌進行鏡檢及革蘭氏染色。

1．硅膠平板分離法

(1)製取硅膠平板取等體積的鹽酸(HC1比重1．09)和硅酸鈉(比重1．10)溶液，徐徐加入，緩慢混合，均勻攪拌，分裝於100-00m1透析袋中．水中透析48h，其間換蒸餾水6—8次，待透析袋內的硅酸納溶液無色透明后，高壓蒸汽滅菌或過濾除菌。灌澆硅膠平板時，注意無菌操作技術，分別吸取預先配製並滅好菌的硝化細菌分離培養基1m1,酸鈉溶液10ml於無菌培養皿內，靜置片刻，待凝固后即可使用。

(2)硅膠平板分離採用塗布分離法。取0.1—0.2m1富集培養液滴於5—10個硝化細菌分離培養基硅膠平板上，塗布分離。然後將硅膠平板放在盛有少量水的乾燥器里(防止水分蒸發，避免硅膠平板乾裂)，於28℃恆溫下培養3—4月，當硅膠平板上出現硝化細菌極小的菌落後(多數菌落小於100μm)，挑取10-20個單菌落，分別接種到硝化細菌增殖培養液中，28℃恆溫下培養3—4周，依前述方法檢驗NO2-及NO3-。

2．稀釋法

按稀釋分離方法取富集培養液稀釋至10-4、10-3、10-6三個稀釋度，分別用無菌滴管於上述稀釋液中吸取培養物1—2滴接種10-20瓶硝化細菌增殖培養液中，28℃恆溫箱中培養3周后，依前述方法檢驗NO2-的減少和NO3-的增長。

3．微口滴管滴分法

此法依據是接種的每小滴培養液中盡量只含有一個硝化細菌的細胞。分離時，用無菌的微口滴管吸取少量富集培養液的上清液接種於盛有硝化細菌增殖培養液的錐形瓶中(接種時傾斜錐形瓶，使瓶底露出培養液的液面，以微口滴管尖端輕輕接觸錐形瓶底即可)，共滴10-20瓶，28℃恆溫培養3—4周，按前述方法檢測NO2-及NO3-的消長。

三種分離純化方法中稀釋法簡便易行，分離效果較好；硅膠平板分離法可直接獲得純種。

屬

細胞形態

鞭毛

革蘭氏

染色結果

硝化桿菌屬

短桿狀有時呈梨形或球形

單鞭毛，通常不運動

G-

硝化球菌屬

球形

偏端鞭毛，運動

G-

硝化刺菌屬

細長直桿狀，老培養物中為球形

不運動

G-