DNA探針

DNA探針根據其來源分為3種：一種來源於基因組中的基因本身，稱為基因組探針（genomic probe），可以是基因的全序列，或者基因上的一段序列；另一種是從相應的基因經轉錄獲得mRNA，再通過逆轉錄得到的探針，稱為cDNA探針（cDNA probe）；此外，還可在體外人工合成20～50個鹼基的與基因序列互補的DNA片段，稱為寡核苷酸探針。

基因組DNA探針地獲得有賴於分子克隆技術的發展和應用。要得到一種特異性DNA探針，常常是比較繁瑣的。以細菌為例，細菌的基因組大小約為5×10鹼基，約含3000個基因。要獲得某細菌特異的核酸探針，通常要採取建立細菌基因組DNA文庫的辦法，即將細菌DNA切成小片段后（如用限制性內切酶做不完全水解）分別克隆得到包含基因組的全信息的克隆庫，然後用多種其他菌種的DNA探針來篩選，產生雜交信號的克隆被剔除，最後剩下的不與任何其他細菌雜交的克隆則可能含有該細菌特異性DNA片段。

cDNA探針是從相應的基因經轉錄獲得mRNA，再通過逆轉錄酶的作用得到的探針，不含內含子序列。

在體外通過機器可以合成小片段單鏈寡核苷酸探針。寡核苷酸探針穩定、特異性高，在非常嚴格的條件下．用寡核苷酸探針進行的雜交試驗能檢測單個鹼基突變和單個鹼基的錯配，但寡核苷酸探針短，帶有的標記物少，敏感性較低。

①DNA探針多克隆在質粒載體中，製備方法簡便；

②DNA探針相對RNA探針（RNA probe）而言不易降解，一般能有效抑制DNA酶活性；

③DNA探針的標記方法較成熟，可用同位素或非同位素標記，有多種方法可供選擇。

DNA探針分為兩類：同位素標記的探針和非同位素標記的探針。同位素標記的探針通常有很高的放射比活性，雜交的靈敏度高，但使用期限短，且有放射性危害，污染物處置困難，需要特殊的儀器和設備，不適用於普通實驗室。近年來非同位素標記法得到很大發展，如酶促標記法（如生物素、地高辛標記法）和化學標記法（如熒光生物素、酶標記法）。非同位素標記的探針保存時間較長、避免了同位素的污染，但不及同位素標記探針敏感。下面以同位素標記法為例介紹DNA探針的標記方法。

1．缺口平移法（nick translation）

缺口平移法是最常用的探針標記法，反應體系的主要成分有DNA酶I（DNase I）、大腸桿菌DNA聚合酶I（DNA polymerase I）、三種三磷酸脫氧核糖核苷酸、一種同位素標記的核苷酸（如dATP、dTTP、dCTP，”P—dGTP），其原理如圖13—1。首先用適當濃度的DNA酶I在探針DNA雙鏈分子上隨機切開若干個缺口（不是切斷DNA或將其降解），然後再藉助於DNA聚合酶I的5 '→3'的外切酶活性，切去5’末端的核苷酸；同時又利用該酶的5’→3’聚合酶活性，使P標記的互補核苷酸補入缺口．DNA聚合酶I的這兩種活性的交替作用，使缺口不斷向3’的方向移動，DNA鏈上的核苷酸不斷為32P標記的核仟酸所取代。由於反應體系中含有同位素標記的單核苷酸，使新合成的鏈帶有同位素標記，所以缺口平移實際上是同位素標記的核苷酸取代了原DNA鏈中不帶同位素的同種核苷酸。

2.隨機引物法

變性的探針溶液加入6個核苷酸的隨機DNA小片段，作為引物，當後者與單鏈DNA多個部位互補結合后，按鹼基互補原則不斷在其3'-OH端添加同位素標記的單核苷酸，這樣也可以獲得放射性比活性很高的DNA探針。

3．末端標記法（end—labelling）

末端標記法不是將DNA進行全長標記，只在其5'端或3’端導入標記物進行部分標記。該標記方法可得到全長DNA探針，因為攜帶的標記分子較少，所以標記比活性不高。

對任何DNA探針測定來說，雜交反應包括四個基本要素：探針、靶物質（樣品中的待測核酸）、檢驗方法（根據採用的標記物或報告基因而定）和雜交模式。核酸分子雜交可分為液相雜交和固相雜交。

1．液相雜交

液相雜交是讓DNA探針和待測核酸在溶液中進行反應。在溶液中，待測核酸和探針均自由運動，增加了兩者結合的機會，因此液相雜交要比固相雜交快5～10倍。但液相雜交不易分離雜交體和遊離核酸探針，常規應用不易。

2．固相雜交

固相雜交是先將待測核酸樣本結合到固相載體上，再與溶於溶液中的檢測雜交信號後分析雜交結果。

固相雜交的基本程序是：①準備待測樣本；②製備和標記探針；③固相載體的處理；④預雜交、雜交、漂洗；⑤雜交信號檢測；⑥結果判斷及分析。

常用的固相雜交方法有斑點雜交法、夾心雜交法和原位雜交法等。下面簡單介紹幾種常用的核酸分子固相雜交方法。

①斑點雜交法（dot blot hybridization）：最常用的雜交模式．將樣品DNA直接點在硝酸纖維素膜或尼龍膜上，在嚴格的條件下雜交後進行檢測。斑點雜交法簡單、迅速，不需要限制性核酸內切酶消化DNA，也不需要凝膠電泳和轉移，且在一張膜上可檢測多個樣品。該方法敏感性高，但對雜交條件控制不嚴可出現非特異性雜交。

②夾心雜交法（sandwich hybridization）：採用位於待測基因兩個相鄰但不重疊的DNA序列製作探針，先將第一個不標記的探針（A探針，捕捉探針）吸附於固相支持物（如膜、孔或管）上，捕捉待測樣本中與其互補的目標序列，然後加入第二個標記的探針（B探針，檢測探針），與其互補序列結合后即可檢測雜交信號。夾心雜交法的優點是特異性好，而且對核酸樣品的純度要求不高。

③原位雜交法（in situ hybridization）：用核酸探針與組織或者細胞中的核酸進行雜交並對其進行檢測的方法。先把待測組織或細胞固定到固相載體上，然後用適當去污劑和蛋白酶、酸等物質處理標本，使標記的核酸探針能進入細胞並與待測核酸形成雜交體，從而可直接檢測到組織或細胞內的核酸序列。原位雜交法為細胞甚至亞細胞水平的核酸檢測提供了直接的方法。