分子雜交技術

互補的核苷酸序列通過Watson-Crick鹼基配對形成穩定的雜合雙鏈分子DNA分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的，可以根據所使用的探針已知序列進行特異性的靶序列檢測。

雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA,也可以是細胞總DNA或總RNA。根據使用的方法被檢測的核酸可以是提純的，也可以在細胞內雜交, 即細胞原位雜交。探針必須經過標記，以便示蹤和檢測。使用最普遍的探針標記物是同位素, 但由於同位素的安全性，近年來發展了許多非同位素標記探針的方法，多使用甾類化合物地高辛配基（digoxigenin，DIG）標記。

核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度的特異性，因而該技術在分子生物學領域中已廣泛地使用於克隆基因的篩選、酶切圖譜的製作、基因組中特定基因序列的定性、定量檢測和疾病的診斷等方面。因而它不僅在分子生物學領域中具有廣泛地應用，而且在臨床診斷上的應用也日趨增多。

核酸探針根據核酸的性質，可分為DNA和RNA探針；根據是否使用放射性標記物的與否，可分為放射性標記探針和非放射性標記探針；根據是否存在互補鏈，可分為單鏈和雙鏈探針；根據放射性標記物摻入情況，可分為均勻標記和末端標記探針。下面將介紹各種類型的探針及標記方法。

分子生物研究中，最常用的探針即為雙鏈DNA探針，它廣泛應用於基因的鑒定、臨床診斷等方面。

雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種：切口平移法和隨機引物合成法。

1. 切口平移法(nick translation) 當雙鏈DNA分子的一條鏈上產生切口時,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3'羥基末端。同時該酶具有從5'→3'的核酸外切酶活性，能從切口的5'端除去核苷酸。由於在切去核苷酸的同時又在切口的3'端補上核苷酸，從而使切口沿著DNA鏈移動，用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素摻入到合成新鏈中。最合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。切口平移反應受幾種因素的影響: (a) 產物的比活性取決於[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的質量會影響產物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性, 故應使用仔細純化后的DNA。

材料：待標記的DNA。

設備：高速台式離心機，恆溫水浴鍋等。

試劑：

(1)10×切口平移緩衝液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml BSA。

(2)未標記的dNTP原液：除同位素標記的脫氧三磷酸核苷酸外，其餘3種分別溶解於50mmol/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中，濃度為0.3mmol/L。

(3)[α-32 P] dCTP或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。

(4) E.coli DNA聚合酶Ⅰ(4單位/μ l):溶於50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。

(5)DNA酶Ⅰ:1mg/ml。

(6)EDTA :200mmol/L (pH8.0)。

(7)10mol/L NH4Ac。

操作步驟:

(1) 按下列配比混合:

未標記的dNTP 10μl

10×切口平移緩衝液 5μl

待標記的DNA 1μg

[α-32 P]dCTP或dATP(70μCi) 7μl

E.coli DNA聚合酶 4單位

DAN酶 I 1μl

加水至終體積 50μl

(2) 置於15℃水浴60分鐘。

(3) 加入5μl EDTA終止反應。

(4) 反應液中加入醋酸銨，使終濃度為0.5mol/L, 加入兩倍體積預冷無水乙醇沉澱回收DNA探針。

[注意]

1、3H，32P及35S標記的dNTP都可使用於探針標記，但通常使用[α-32 P]-dNTP。

2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探針比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，則所得探針比活性高，但長度比較短。

隨機引物合成法

隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探針。合成產物的大小、產量、比活性依賴於反應中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，產物平均長度為400-600個核苷酸。利用隨機引物進行反應的優點是：(1)Klenow片段沒有5'→3'外切酶活性，反應穩定，可以獲得大量的有效探針。(2)反應時對模板的要求不嚴格，用微量製備的質粒DNA模板也可進行反應。(3)反應產物的比活性較高，可達4×109 cpm/μg探針。(4)隨機引物反應還可以在低熔點瓊脂糖中直接進行。

材料：待標記的DNA片段。

設備：高速台式離心機，恆溫水浴鍋等。

試劑：

(1)隨機引物（隨機六聚體或斷裂的鮭魚精子DNA）。

(2)10×隨機標記緩衝液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。

(3)Klenow片段。

(4)20mmol/L DTT。

(5)未標記的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。

(6)[α-32 P] dATP：比活性>3000Ci/mmol, 10μCi/μl。

(7)緩衝液A：50mmol/L Tris·Cl （pH7.5）; 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA （pH8.0）; 0.5% SDS。

操作步驟:

(1) 200ng雙鏈DNA(1μl)和7.5ng隨機引物(1μl)混合後置於eppendorf管內，水浴煮沸5分鐘后，立即置於冰浴中1分鐘。

(2) 與此同時，儘快在一置於冰浴中的0.5ml eppendorf管內混合下列化合物:

20mmol/L DTT 1μl

未標記的dNTP溶液 1μl

10×隨機標記緩衝液 1μl

[α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl) 3μl

ddH2O 1μl

(3) 將步驟(1)eppendorf管中的溶液移到步驟(2)管中。

(4) 加入5單位(約1μl) Klenow片段, 充分混合，在微型離心機中以12000g離心1-2秒, 使所有溶液沉於試管底部，在室溫下保溫3-16小時。

(5) 在反應液中加入10μl緩衝液A后，將放射性標記的探針保存在-20℃下備用。同時計算放射比活性。

[注意]1、引物與模板的比例應仔細調整，當引物高於模板時，反應產物比較短，但產物的累積較多；反之，則可獲得較長片段的探針。

2、模板DNA應是線性的，如為超螺旋DNA，則標記效率不足50%。

用雙鏈探針雜交檢測另一個遠緣DNA時，探針序列與被檢測序列間有很多錯配。而兩條探針互補鏈之間的配對卻十分穩定，即形成自身的無效雜交，結果使檢測效率下降。採用單鏈探針則可解決這一問題。單鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:(1) 以M13載體衍生序列為模板，用Klenow片段合成單鏈探針; (2) 以RNA為模板, 用反轉錄酶合成單鏈cDNA探針。

1. 從M13載體衍生序列合成單鏈DNA探針 合成單鏈DNA探針可將模板序列克隆到噬粒或M13噬菌體載體中，以此為模板，以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸為引物, 在[a-32P]-dNTP的存在下，由Klenow片段作用合成放射標記探針，反應完畢后得到部分雙鏈分子。在克隆序列內或下游用限制性內切酶切割這些長短不一的產物，然後通過變性凝膠電泳(如變性聚丙烯醯胺凝膠電泳)將探針與模板分離開。雙鏈RF型M13 DNA也可用於單鏈DNA的製備，選用適當的引物即可製備正鏈或負鏈單鏈探針。

材料：已製備好的單鏈DNA模板（方法參見第十章中有關內容）。

設備：高速台式離心機，恆溫水浴鍋等。

試劑：

(1)10×Klenow緩衝液：0.5mol/L NaCl, 0.1mol/L Tris·Cl(pH7.5); 0.1mol/L MgCl2。

(2)0.1mol/L DTT溶液。

(3) [α-32 P] dATP：3000Ci/mmol, 10μCi/μl。

(4)40mmol/L和20mmol/L的未標記的dNTP溶液。

(5)dCTP,dTTP,dGTP各20mmol/L的溶液。

(6) Klenow片段（5單位/ml）。

(7)適宜的限制酶，如EcoRⅠ、HindⅢ等。

(8)0.5mol/L EDTA （pH8.0）。

操作步驟：

(1)在0.5ml eppendorf管中混合如下溶液：

單鏈模板（約0.5pmol） 1mg

適當引物 5pmol

10×Klenow緩衝液 3ml

加水至 20ml

(2)將eppendorf管加熱到85℃ 5分鐘，在30分鐘內，使小離心管降到37℃；

(3)依次加入：

DTT 2ml

[a-32P]dATP 5ml

未標記的dATP 1ml

dGTP,dCTP,dTTP混合液 1ml

混合均勻后，稍離心使之沉於試管底部。

(4)加1ml（5單位）Klenow酶室溫下30分鐘。

(5)加1ml20mmol/L未標記的dATP溶液20分鐘。

(6)68℃加熱10分鐘，使Klenow片段失活。調整NaCl濃度，使之適宜於酶切。

(7)加入20單位限制性內切酶（如EcoRⅠ, HindⅢ等）酶切1小時。

(8)酚/氯仿抽提DNA，乙醇沉澱以去除dNTP或加0.5mol/L EDTA(pH8.0)至終濃度10mmol/L。

(9)用電泳方法分離放射性標記的探針。

2. 從RNA合成單鏈cDNA探針 cDNA單鏈探針主要用來分離cDNA文庫中相應的基因。用RNA為模板合成cDNA探針所用的引物有兩種: (1)用寡聚dT為引物合成cDNA探針。本方法只能用於帶Poly(A)的mRNA,並且產生的探針極大多數偏向於mRNA 3'末端序列。(2) 可用隨機引物合成cDNA探針。該法可避免上述缺點，產生比活性較高的探針。但由於模板RNA中通常含有多種不同的RNA分子，所得探針的序列往往比以克隆DNA為模板所得的探針複雜得多, 應預先盡量富集mRNA中的目的序列。

反轉錄得到的產物RNA/DNA雜交雙鏈經鹼變性后,RNA單鏈可被迅速地降解成小片段，經Sephadex G-50柱層析即可得到單鏈探針。材料：已提純的RNA或mRNA

設備：高速台式離心機，恆溫水浴鍋等。

試劑：

(1)合適的引物：隨機引物或oligo(dT)15-18。

(2)5mmol/L dGTP, dATP dCTP, dTTP。

(3) [a-32P]dCTP(>3000Ci/mmol, 10mCi/ml)。

(4)反轉錄酶(200000單位/ml)。

(5)100mmol/L DTT。

(6)250mmol/L MgCl2。

(7)1mol/L KCl。

(8)0.5mol/L EDTA (pH8.0)。

(9)10% SDS。

(10)RNasin(40單位/ml)。

操作步驟:

(1)在已置於冰浴中的滅菌離心管中加入下列試劑：

RNA或mRNA 10.0ml

合適的產物(1mg/ml) 10.0ml

1mol/L Tris·Cl(pH7.6) 2.5ml

1mol/L KCl 3.5ml

250mmol/L MgCl2 2.0ml

5mmol/L dNTP 10.0ml

[a-32P]dCTP 10.0ml

0.1mol/L DTT 2.0ml

Rnasin 20U

加水至 48ml

反轉錄酶(200000單位/ml) 2ml

混勻后，稍稍離心，37℃保溫2小時。

(2) 反應完畢后加入下列試劑： 0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2ml 10% SDS 2ml

(3) 加入3ml 3mol/L NaOH。68℃保溫30分鐘以水解RNA。

(4) 冷卻至室溫后, 加入10ml 1mol/L Tris·Cl (pH7.4)。混勻。然後加入3ml 2mol/L HCl。

(5) 酚/氯仿抽提后，用Sephadex G-50柱層析或乙醇沉澱法分離標記的探針。 [注意] RNA極易降解，因而實驗中的所有試劑和器皿均應在DEPC處理后，滅菌備用。

現以Klenow片段標記3'末端為例說明末端標記的方法。

1、材料：待標記的雙鏈含凹缺3'末端的DNA。

2、設備：高速台式離心機，水浴鍋等。

3、試劑：

(1)3種不含標記的dNTP各為200mmol/L。

(2)合適的限制酶。

(3)[α-32P] dNTP:3000Ci/mmol, 10mCi/ul。

(4)Klenow片段(5U/ml)。

(5)10×末端標記緩衝液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2), 0.1mol/L MgSO4, 1mmol/L DTT, 500mg/ml BSA。

4、操作步驟：

(1)25μl反應體系中用合適的限制酶酶切1μg的DNA。

(2)按下列成分加入試劑並混勻：已酶切的DNA 1mg (25ml) 10×末端標記緩衝液 5ml 2mmol/L 3種dNTP 1ml [a-32P]-dNTP 適量 加水至 50ml

(3)加入1單位的Klenow片段，室溫下反應30分鐘。

(4)加入1ml 2mmol/L 第四種核苷酸溶液, 室溫保溫15分鐘。

(5)70℃加熱5分鐘，終止反應。

(6)用酚/氯仿抽提后，用乙醇沉澱來分離標記的DNA,或用Sephdadex G-50柱層析分離標記的DNA。

[注意]

1、利用本方法可對DNA分子量標準進行標記，利用它可定位因片段太小而無法在凝膠中觀察的DNA片段。

2、對DNA的純度不很嚴格，少量製備的質粒也可進行末端標記合成探針。

3、末端標記還有其他的一些方法，如利用T4多核苷酸激酶標記脫磷的5'端突出的DNA和平末端凹缺DNA分子，也可利用該酶進行交換反應標記5'末端。

利用寡核苷酸探針可檢測到靶基因上單個核苷酸的點突變。常用的寡核苷酸探針主要有兩種：單一已知序列的寡核苷酸探針和許多簡併性寡核苷酸探針組成的寡核苷酸探針庫。單一已知序列寡核苷酸探針能與它們的目的序列準確配對，可以準確地設計雜交條件，以保證探針只與目的序列雜交而不與序列相近的非完全配對序列雜交，對於一些未知序列的目的片段則無效。

1、材料：待標記的寡核苷酸(10pmol/μl)。

2、設備：高速離式離心機，恆溫水浴鍋等。

3、試劑：

(1)10×T4多核苷酸激酶緩衝液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6), 0.1mol/L MgCl2 , 50mmol/L DTT, 1mmol/L Spermidine·HCl, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。

(2)[γ-32 P] ATP(比活性7000Ci/mmol; 10mCi/ml)。

(3)T4多核苷酸激酶（10單位/ml）。

4、操作步驟：

(1)100ng寡核苷酸溶於30ml水中。置65℃變性5分鐘，迅速置冰溶中。

(2)立即加入下列試劑：

10×激酶緩衝液 5ml

[g-32P]ATP(比活性7000Ci/mmol;10mCi/ml) 10ml

T4多核苷酸激酶 2ml

加水至 50ml

混勻後置37℃水浴20分鐘。

(3)再加入20單位T4多核苷酸激酶，置37℃水浴20分鐘后立即置冰浴中。

(4)Sephadex G-50柱層析。

此方法是在每個探針的5'末端多加了一個磷酸，理論上，這會影響其與DNA的雜交。因此，建議使用Klenow DNA聚合酶的鏈延伸法獲得高放射性的寡核苷酸探針。

除了常見的同位素標記探針外，還有利用非同位素標記探針和雜交的方法，許多公司都有不同的非同位素標記探針的雜交系統出售，可根據這些公司所提供的操作步驟進行探針的標記和雜交。

許多載體如pBluescript, pGEM等均帶有來自噬菌體SP6或E.coli噬菌體T7或T3的啟動子，它們能特異性地被各自噬菌體編碼的依賴於DNA的RNA聚合酶所識別，合成特異性的RNA。在反應體系中若加入經標記的NTP，則可合成RNA探針。RNA探針一般都是單鏈，它具有單鏈DNA探針的優點，又具有許多DNA單鏈探針所沒有的優點，主要是： RNA:DNA雜交體比DNA:DNA雜交體有更高的穩定性，所以在雜交反應中RNA探針比相同比活性的DNA探針所產生信號要強。 RNA:RNA雜交體用RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA雜交體容易控制，所以用RNA探針進行RNA結構分析比用DNA探針效果好。

噬菌體依賴DNA的RNA聚合酶所需的rNTP濃度比Klenow片段所需的dNTP濃度低，因而能在較低濃度放射性底物的存在下，合成高比活性的全長探針。用來合成RNA的模板能轉錄許多次，所以RNA的產量比單鏈DNA高。並且用來合成RNA的模板能轉錄多次，可獲得比單鏈DNA更高產量的RNA。

反應完畢后，用無RNA酶的DNA酶Ⅰ處理，即可除去模板DNA,而單鏈DNA探針則需通過凝膠電泳純化才能與模板DNA分離。

另外噬菌體依賴於DNA的RNA聚合酶不識別克隆DNA序列中的細菌、質粒或真核生物的啟動子，對模板的要求也不高，故在異常位點起始RNA合成的比率很低。因此，當將線性質粒和相應的依賴DNA的RNA聚合酶及四種rNTP一起保溫時，所有RNA的合成，都由這些噬菌體啟動子起始。而在單鏈DNA探針合成中，若模板中混雜其他DNA片段，則會產生干擾。但它也存在著不可避免的缺點，因為合成的探針是RNA，它對RNase特別敏感，應而所用的器皿試劑等均應仔細地去除RNase；另外如果載體沒有很好地酶切則等量的超螺旋DNA會合成極長的RNA，它有可能帶上質粒的序列而降低特異性。

分子雜交是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然後用放射性標記的探針與被固定的分子雜交，經顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。根據被測定的對象，分子雜交基本可分為以下幾大類：

(1) Southern雜交:DNA片段經電泳分離后，從凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然後與探針雜交。被檢對象為DNA,探針為DNA或RNA。

(2) Northern雜交:RNA片段經電泳后，從凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜上，然後用探針雜交。被檢對象為RNA,探針為DNA或RNA。

根據雜交所用的方法，另外還有斑點(dot)雜交、狹槽(slot)雜交和菌落原位雜交等。有3種固相支持體可用於雜交：硝酸纖維素濾膜、尼龍膜和Whatman 541濾紙。不同商標的尼龍膜需要進行不同的處理，在DNA固定和雜交的過程中要嚴格按生產廠家的說明書來進行。Whatman 541濾紙有很高的濕強度，最早用於篩選細菌菌落。該濾紙主要用於篩選一些基因文庫。固定化DNA的雜交條件基本與使用硝酸纖維素濾膜時所建立的條件相同。Whatman 541濾紙與硝酸纖維素濾膜相比有一些優點：它更便宜，雜交中更耐用，乾燥過程中不易變形和碎裂等。然而若變性過程不小心，雜交信號的強度會明顯弱於用硝酸纖維素濾膜時所得到的信號強度。因此，常規的細菌篩選和各種雜交時仍選用硝酸纖維素濾膜作為固相支持體。

Southern雜交可用來檢測經限制性內切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列，它包括下列步驟:

(1) 酶切DNA, 凝膠電泳分離各酶切片段，然後使DNA原位變性。

(2) 將DNA片段轉移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。

(3) 預雜交濾膜，掩蓋濾膜上非特異性位點。

(4) 讓探針與同源DNA片段雜交，然後漂洗除去非特異性結合的探針。

(5) 通過顯影檢查目的DNA所在的位置。

Southern雜交能否檢出雜交信號取決於很多因素，包括目的DNA在總DNA中所佔的比例、探針的大小和比活性、轉移到濾膜上的DNA量以及探針與目的DNA間的配對情況等。在最佳條件下，放射自顯影曝光數天後, Southern雜交能很靈敏地檢測出低於0.1pg與32 P標記的高比活性探針的(>109 cpm/μg)互補DNA。如果將10μg基因組DNA轉移到濾膜上，並與長度為幾百個核苷酸的探針雜交，曝光過夜，則可檢測出哺乳動物基因組中1kb大小的單拷貝序列。

將DNA從凝膠中轉移到固體支持物上的方法主要有3種:(1)毛細管轉移。本方法由Southern發明，故又稱為Southern轉移(或印跡)。毛細管轉移方法的優點是簡單，不需要用其他儀器。缺點是轉移時間較長，轉移后雜交信號較弱。(2)電泳轉移。將DNA變性后，可電泳轉移至帶電荷的尼龍膜上。該法的優點是不需要脫嘌呤/水解作用，可直接轉移較大的DNA片段。缺點是轉移中電流較大，溫度難以控制。通常只有當毛細管轉移和真空轉移無效時，才採用電泳轉移。(3) 真空轉移。有多種真空轉移的商品化儀器，它們一般是將硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上，再將凝膠置於濾膜上，緩衝液從上面的一個貯液槽中流下，洗脫出凝膠中的DNA,使其沉積在濾膜上。該法的優點是快速，在30分鐘內就能從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度(<1%)的凝膠中定量地轉移出來。轉移后得到的雜交信號比Southern轉移強2-3倍。缺點是如不小心，會使凝膠碎裂, 並且在洗膜不嚴格時，其背景比毛細轉移要高。

1、材料：待檢測的DNA，已標記好的探針。

2、設備：電泳儀，電泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自顯影盒，X-光片，雜交袋，硝酸纖維素濾膜或尼龍膜，濾紙。

3、試劑：

(1)10mg/ml 溴化乙錠（EB）。

(2)50×Denhardt's溶液：5g Ficoll-40, 5g PVP, 5g BSA加水至500ml,過濾除菌後於-20℃儲存。

(3)1×BLOTTO:5g脫脂奶粉，0.02%疊氮鈉，儲於4℃。

(4)預雜交溶液:6×SSC, 5×Denhardt, 0.5% SDS, 100mg/ml鮭魚精子DNA, 50%甲醯胺。

(5)雜交溶液：預雜交溶液中加入變性探針即為雜交溶液。

(6)0.2mol/L HCl。

(7)0.1% SDS。

(8)0.4mol/L NaOH。

(9)變性溶液:87.75g NaCl, 20.0g NaOH加水至1000ml。

(10)中和溶液:175.5g NaCl, 6.7g Tris·Cl, 加水至1000ml。

(11)硝酸纖維素濾膜。

(12)20×SSC: 3mol/L NaCl, 0.3mol/L檸檬酸鈉，用1mol/L HCl調節pH至7.0;

(13)2×、1×、0.5×、0.25×和0.1×SSC:用20×SSC稀釋。

4、操作步驟：

(1) 約50μl體積中酶切10pg-10μg的DNA, 然後在瓊脂糖凝膠中電泳12-24小時(包括DNA分子量標準物)。

(2) 500ml水中加入25μl 10mg/ml溴化乙錠，將凝膠放置其中染色30分鐘, 然後照相。

(3) 依次用下列溶液處理凝膠，並輕微搖動: 500ml 0.2mol/L HCl 10分鐘, 傾去溶液(如果限制性片段>10kb, 酸處理時間為20分鐘)，用水清洗數次，傾去溶液; 500ml變性溶液兩次，每次15分鐘，傾去溶液; 500ml中和溶液30分鐘。如果使用尼龍膜雜交，本步可以省略。

(4) 戴上手套，在盤中加20×SSC液，將硝酸纖維素濾膜先用無菌水完全濕透，再用20×SSC浸泡。將硝酸纖維素濾膜一次準確地蓋在凝膠上，去除氣泡。用浸過20×SSC液的3濾紙蓋住濾膜，然後加上乾的3濾紙和干紙巾，根據DNA複雜程度轉移2-12小時。當使用尼龍膜雜交時，該膜用水浸潤一次即可，轉移時用0.4mol/L NaOH代替20×SSC。簡單的印跡轉移2-3小時，對於基因組印跡，一般需要較長時間的轉移。

(5) 去除紙巾等，用藍色圓珠筆在濾膜右上角記下轉移日期，做好記號，取出濾膜，在2×SSC中洗5分鐘，涼干后在80℃中烘烤2小時。注意在使用尼龍膜雜交時，只能空氣乾燥，不得烘烤。

(6) 將濾膜放入含6-10ml預雜交液的密封小塑料袋中，將預雜交液加在袋的底部，前後擠壓小袋，使濾膜濕透。在一定溫度下(一般為37-42℃)預雜交3-12小時，棄去預雜交液。

(7) 製備同位素標記探針（參見第一節），探針煮沸變性5分鐘。

(8) 在雜交液中加入探針，混勻。如步驟（6）將混合液注入密封塑料袋中，在與預雜交相同溫度下雜交6-12小時。

(9) 取出濾膜，依次用下列溶液處理，並輕輕搖動: 在室溫下, 1×SSC/0.1% SDS, 15分鐘, 兩次。在雜交溫度下, 0.25×SSC/0.1% SDS, 15分鐘, 兩次。

(10) 空氣乾燥硝酸纖維素濾膜，然後在X光片上曝光。通常曝光1-2天後可見DNA譜帶。對於≥108 cpm/μg從缺口平移所得探針，可很容易地從10μg哺乳DNA中檢測到10pg的單拷貝基因。

Northern雜交與Southern雜交很相似。主要區別是被檢測對象為RNA,其電泳在變性條件下進行，以去除RNA中的二級結構，保證RNA完全按分子大小分離。變性電泳主要有3種：乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。電泳后的瓊脂糖凝膠用與Southern轉移相同的方法將RNA轉移到硝酸纖維素濾膜上，然後與探針雜交。

1、材料：待檢測的RNA及製備好的探針。

2、設備：電泳儀，電泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自顯影盒，X-光片，雜交袋，硝酸纖維素膜或尼龍膜。

3、試劑：

(1)20×SSPE:175.3g NaCl, 88.2g檸檬酸鈉，溶於800ml水中，用10mol/LNaOH調pH至7.4，定溶到1L。

(2)其他試劑：與Southern雜交試劑類似，只是所有的試劑均應用DEPC處理。

4、操作步驟：

(1)RNA經變性電泳完畢后，可立即將乙醛醯RNA轉移至硝酸纖維素濾膜上。轉移方法與轉移DNA的方法相似。

(2)轉移完畢后 ,以6×SSC溶液於室溫浸泡此膜5分鐘，以除去瓊脂糖碎片。

(3)將該雜交膜夾於兩張濾紙中間，用真空烤箱於80℃乾燥0.5-2小時。

(4) 用下列兩種溶液之一進行預雜交，時間為1-2小時。若於42℃進行，應採用: 50%甲醯胺，5×SSPE，2×Denhardt's試劑，0.1% SDS；若於68℃進行，應採用:6×SSC，2×Denhardt's試劑，0.1% SDS，（注意：BLOTTO不能用於Northern雜交）。

(5) 在預雜交液中加入變性的放射性標記探針，如欲檢測低丰度mRNA,所用探針的量至少為0.1μg,其放射性比活度應大於2×108 cpm/分·μg,放在適宜的溫度條件下雜交16-24小時。

(6) 用1×SSC、0.1% SDS於室溫洗膜20分鐘，隨後用0.2×SSC、0.1% SDS於68℃洗膜3次，每次20分鐘。

(7) 用X光片(Kodak XAR-2或與之相當的產品)進行放射自顯影，附加增感屏於-70℃曝光24-48小時。

[注意]

(1)如果瓊脂糖濃度高於1%，或凝膠厚度大於0.5cm，或待分析的RNA大於2.5kb,需用0.05mol/LNaOH浸泡凝膠20分鐘，部分水解RNA並提高轉移效率。浸泡後用經DEPC處理的水淋洗凝膠，並用20×SSC浸泡凝膠45分鐘。然後再轉移到濾膜上。

(2)在步驟(3)的操作中，如果濾膜上含有乙醛醯RNA,雜交前需用20mmol/L Tris·Cl (pH8.0)於65℃洗膜，以除去RNA上的乙二醛分子。

(3)RNA自凝膠轉移至尼龍膜所用方法，與RNA轉移至硝酸纖維素濾膜所用方法類似。

(4)含甲醛的凝膠在RNA轉移前需用經DEPC處理的水淋洗數次，以除去甲醛。當使用尼龍膜雜交時注意，有些帶正電荷的尼龍膜在鹼性溶液中具有固著核酸的能力，需用7.5mmol/LNaOH溶液洗脫瓊脂糖中的乙醛醯RNA，同時可部分水解RNA，並提高較長RNA分子(>2.3kb)轉移的速度和效率。此外，鹼可以除去mRNA分子的乙二醛加合物，免去固定后洗脫的步驟。乙醛醯RNA在鹼性條件下轉移至帶正電荷尼龍膜的操作也按DNA轉移的方法進行，但轉移緩衝液為7.5mmol/LNaOH，轉移結束后(4.5-6.0小時)，尼龍膜需用2×SSC、0.1%SDS淋洗片刻、於室溫晾乾。

(5)尼龍膜的不足之處是背景較高，用RNA探針時尤為嚴重。將濾膜長時間置於高濃度的鹼性溶液中，會導致雜交背景明顯升高，可通過提高預雜交和雜交步驟中有關阻斷試劑的量來予以解決。

(6)如用中性緩衝液進行RNA轉移，轉移結束后，將晾乾的尼龍膜夾在兩張濾紙中間,80℃干烤0.5-2小時，或者254nm波長的紫外線照射尼龍膜帶RNA的一面。后一種方法較為繁瑣，但卻優先使用，因為某些批號的帶正電荷的尼龍膜經此處理后，雜交信號可以增強。然而為獲得最佳效果，務必確保尼龍膜不被過度照射，適度照射可促進RNA上小部分鹼基與尼龍膜表面帶正電荷的胺基形成交聯結構，而過度照射卻使RNA上一部分胸腺嘧啶共價結合於尼龍膜表面，導致雜交信號減弱。

對分散在若干個瓊脂平板上的少數菌落（100-200）進行克隆篩選時，可採用本方法。將這些菌落歸併到一個瓊脂主平板以及已置於第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經培養一段時間后，對菌落進行原位裂解。主平板應貯存於4℃直至得到篩選結果。

1、材料：待檢測的細菌平皿，已標記好的探針，硝酸纖維素濾膜等。

2、設備：恆溫烤箱，恆溫水浴，台式高速離心機等。

3、試劑：

(1)LB固體培養基。

(2)0.5mol/L NaOH。

(3)1mol/L Tris·Cl。

(4)1.5mol/L NaCl。

(5)0.5mol/L Tris·Cl。

(6)預洗液：5×SSC, 0.5%SDS, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。

(7)預雜交液：50%甲醯胺，6×SSC（或6×SSPE），0.05×BLOTTO(甲醯胺可不用)。

(8)其餘試劑：與Southern雜交相同。

4、操作步驟：

1. 將少數菌落轉移到硝酸纖維素濾膜上：

(1) 在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。

(2) 用無菌牙籤將各個菌落先轉移至濾膜上，再轉移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應按一定的格子進行劃線接種(或打點)。每菌落應分別劃線於兩個平板的相同位置上。最後，在濾膜和主平板上同時劃一個含有非重組質粒（如pBR322)的菌落。

(3) 倒置平板，於37℃培養至劃線的細菌菌落生長到0.5-1.0mm的寬度。

(4) 用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂，在3個以上的不對稱位置作標記。在主平板大致相同的位置上也作上標記。

(5) 用Parafilm膜封好主平板，倒置貯放於4℃,直至獲得雜交反應的結果。

(6) 裂解細菌，按本段下面所述方法，使釋放的DNA結合於硝酸纖維素濾膜。

2. 菌落的裂解及DNA結合於硝酸纖維素濾膜

(1) 在一張保鮮膜上製作一個裝有0.5mol/L NaOH的小窪(0.75ml),使菌落面朝上，將濾膜放到小窪上，展平保鮮膜，使濾膜均勻濕潤，讓濾膜留於原處2-3分鐘。

(2) 用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜，用一張新的保鮮膜和新配製的0.5mol/L NaOH重複步驟(1)。

(3) 吸干濾膜，將濾膜轉移到新的帶有1mol/L Tris·Cl(pH7.4)的保鮮膜窪上。5分鐘后吸干濾膜, 再重複一次該步驟。

(4) 吸干濾膜，把它轉移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4)的保鮮膜小窪上5分鐘后吸干濾膜，轉移到一張乾的濾紙上，置於室溫20-30分鐘，使濾膜乾燥。

(5) 將濾膜夾在兩張乾的濾紙之間，在真空烤箱中於80℃干烤2小時，固定DNA。

(6) 將固定在膜上的DNA與32 P標記的探針雜交。

5.雜交

(1) 盛有2×SSC的塑料盤同，將干烤的濾膜飄浮在液面上，徹底浸濕5分鐘。

(2) 將濾膜轉到200ml預洗液的玻璃皿中。濾膜何疊在一起，放於溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿，放到位於培養箱內的旋轉平台上。於50℃處理30分鐘。在這一步及以後的所有步驟中，應緩緩搖動濾膜，防止它們粘在一起。

(3) 用泡過預洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細菌碎片，以降低雜交背景而不影響陽性雜交信號的強度和清晰度。

(4) 將濾膜轉到盛有150ml預雜交液的玻璃中，在適宜溫度(即在水溶液中雜交時用68℃，而在50%甲醯胺中雜交時用42℃)下，預雜交1-2小時。

(5) 將32 P標記的雙鏈DNA探針於100℃加熱5分鐘，迅速置於冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應蓋嚴，以防液體蒸發。

(6) 雜交結束后，去除雜交液，立即於室溫把濾膜放入大體積(300-500ml)的2×SSC和0.1% SDS溶液中，輕輕振搖5分鐘，並將濾膜至少翻轉一次。重複洗 一次，同時應避免膜乾涸。

(7)68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次，每次1-1.5小時。此時已可進行放射自顯影。如背景很高或實驗要求嚴格的洗膜條件，可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液於68℃將濾膜浸泡60分鐘。

(8) 把濾膜放在紙巾上於室溫晾乾后，把濾膜(編號面朝上)放在一張保鮮膜上，並在保鮮膜上作幾個不對稱的標記，以使濾膜與放射性自顯影片位置對應。

(9) 用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X光片並加上增感屏於-70℃曝光12-16小時。

(10) 底片顯影后，在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標記陽性雜交信號的位置，同時在不對稱分佈點的位置上作出標記。可從底片上取下透明紙，通過對比紙上的點與瓊脂上的點來鑒定陽性菌落。

斑點雜交是指將DNA或RNA樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上，然後與核酸探針分子雜交，以顯示樣品中是否存在特異的DNA或RNA。同一種樣品經不同倍數的稀釋，還可以得到半定量的結果。所以它是一種簡便、快速、經濟的分析DNA或RNA的方法，在基因分析和基因診斷中經常用到，是研究基因表達的有力工具。但由於目的序列未與非目的序列分離，不能了解目的序列的長度。尤其當本底干擾較高時，難以區分目的序列信號和干擾信號。

1、材料：待分析的DNA或RNA樣品，已標記的探針。

2、設備：狹槽點樣器，真空泵，恆溫水浴，真空烤箱等。

3、試劑：

（1）100% 甲醯胺。

（2）甲醛(37%)。

（3） 20×SSC。

（4）0.1mol/L NaOH。

（5）硝酸纖維素濾膜。

（6）濾紙。

4、操作步驟：

(1) 10μl樣品與20μl 100%甲醯胺、 7μl 37%甲醛、2μl 20×SSC混合。混合置於68℃，15分鐘後置冰浴中。

(2) 用0.1mol/L NaOH清洗點樣器，再用無菌水充分沖洗。將一張經20×SSC浸潤的濾紙鋪在點樣器上，上面再鋪上一張經20×SSC浸潤1小時的硝酸纖維素濾膜，加蓋並夾緊，接通真空泵。

(3) 用10×SSC清洗各樣孔。在每一樣品中加兩倍體積的2×SSC,混合后加樣於孔中。外圍幾個孔中加2μl染料定位，緩慢抽吸。每孔用1ml 10×SSC清洗兩次。繼續抽吸5分鐘，吸干濾膜。

(4) 取出濾膜，夾在兩張濾紙中間, 80℃真空烘乾2小時。按上述Southern或Norhtern雜交所述的方法與放射性標記探針雜交。

[注意]

1、在放射自顯影時應注意濾膜必須乾燥，並覆蓋上保鮮膜，否則，濾膜將與X-光片粘在一起，使以後的操作困難。

2、在雜交過程中，整個濾膜應一直是濕潤的，不得乾涸。

第三節 雜交反應的條件及參數的優化

不同的反應條件對雜交結果的影響如下：

(1) 根據雜交液的體積確定雜交的時間：一般來說使用較小體積的雜交液比較好，因為在小體積溶液中，核酸重新配對的速度快、探針用量少，從而使濾膜上的DNA在反應中起主要作用。但在雜交中必須保證有足夠的雜交溶液覆蓋雜交膜。

(2) 根據所用的雜交溶液確定雜交的溫度：一般來說，雜交相為水溶液時，則在68℃雜交，而在50%甲醯胺溶液中時，則在42℃下雜交。

(3) 選用不同的封閉試劑：如Denhardt's試劑、肝素或一種由5%脫脂奶粉組成的BLOTTO, 這些試劑中需加入斷裂的鮭魚精子DNA或酵母DNA，並和SDS一起使用。與Denhardt's試劑相比, BLOTTO價格便宜，使用方便，同樣可獲得滿意的結果，但它不能用於RNA雜交。一般而言，尼龍膜用Denhardt's試劑比用BLOTTO能得到更高的信噪比。對硝酸纖維素濾膜而言，通常在預雜交溶液和雜交溶液中都含有封閉劑。但是對尼龍膜，經常從雜交溶液中省去封閉劑，因為高濃度的蛋白質會幹擾探針和目的基因的退火。

(4)根據需要在雜交過程中選用不同的振蕩方法和程度，許多雜交膜一起反應時，連續的輕微振蕩可獲得較好的雜交結果。

(5) 在雜交過程中加入其他化合物, 如反應體系中加入10%硫酸葡聚糖或10% PEG, 雜交速度可增加約10倍。檢測稀有序列時常用該方法，但它們有時會導致本底較高，並由於溶液的粘稠性而使操作困難。因此，除非在濾膜上含有的目的DNA量很少，或放射性探針的量有限, 一般不用硫酸葡聚糖或PEG。

(6) 根據探針與被檢測目標之間的同源程度選擇清洗的程度，如具有很高的同源性可選用嚴緊型洗脫方式（高濃度SSC）, 反之則選用非嚴緊型洗脫方式（低濃度SSC）。洗脫通常在低於雜交體解鏈溫度12-20℃的條件下進行。解鏈溫度(melting temperature, Tm )是指在雙鏈DNA或RNA分子變性形成分開的單鏈時光吸收度增加的中點處溫度。通常富含G·C鹼基對的序列比富含A·T鹼基對序列的Tm 溫度高。有關Tm的計算方法，請參考第八章。

(7) 根據標記探針的濃度及其比活性，選擇不同的雜交條件及檢測方法。一般使用新的同位素可獲得較強的信號。

(8) 在水溶液中雜交時，用6×SSC或6×SSPE溶液的效果都一樣。但在甲醯胺溶液中雜交時，應該用具有更強緩衝能力的6×SSPE。

上述這些條件的改變，對雜交的結果有不同的影響，應根據研究的具體情況，選用適當的方法。