嗅鞘細胞

嗅鞘細胞是目前所發現的極少數的中樞神經系統可以再生細胞之一。其特點為終身具有神經再生功能，還能夠釋放多種神經營養因子、神經粘附分子，被認為是髓鞘化能力最強的膠質細胞。逐漸用於治療脊髓損傷。嗅鞘細胞與膠質細胞、許旺細胞在表現型上有共同點，它們都能促進軸突的再生，主要區別在於嗅鞘細胞不但存在於中樞神經系統，也存在於外周神經中。嗅黏膜中的神經元是唯一生后才生長並在成年時繼續分化的神經元，壽命為4～12周，隨著新細胞的生長，又建立了新的神經支配關係。嗅鞘細胞存在於嗅神經及嗅球的神經層上，沿嗅神經的全長，從周圍神經系統到中樞神經分佈。

OECs和嗅上皮均來源於嗅基板，而嗅球與其它中樞神經系統結構均起源於神經管，因此在胚胎髮育過程中嗅上皮與嗅球發育是兩種不同的方向，原始嗅覺神經元伴隨大量基板細胞從嗅上皮傳出軸突向端腦泡方向遷移，其中嗅鞘細胞引導嗅神經軸突到達端腦泡，這些細胞形成早期的嗅球，接著嗅球發生外翻，遷移細胞覆在其表面形成一薄層，接著它們穿透膠質界膜引導形成嗅神經層和小球層，成為覆蓋在嗅球表面新的膠質界膜，不同於中樞神經系統和其它組織的是：在成人階段嗅鞘細胞依然可穿過這種膠質界膜。

嗅鞘細胞是一種嗅神經的支持細胞，它包被神經軸突遷徙入腦，在顱底它和嗅球的僧帽細胞相結合。分佈於嗅神經的全長，從嗅上皮基底膜一直到嗅球，主要位於嗅神經的纖維層，至於是否深入到顆粒層仍存在爭議。嗅鞘細胞具有雪旺氏細胞和星形膠質細胞的特性，但總的表現更趨於前者，它有兩個獨特的特徵。第一，它不僅存在於外周神經（雪旺氏細胞），而且存在於中樞神經（星形膠質細胞）；第二，嗅粘膜具有終生再生能力，包括人類的嗅鞘細胞，這種再生是嗅鞘細胞參與高效調控的過程，儘管現在不清楚具體的機制。嗅鞘細胞不同於星形細胞和雪旺氏細胞，但同時兼有這兩種細胞的特性，有象雪旺氏細胞有助於軸突生長的作用，但比雪旺氏細胞更能使軸突長距離生長，即具有更強的遷徙性；也有象星形膠質細胞一樣對神經元的存活及軸突的生長具有營養作用，但嗅鞘細胞還能夠包裹神經元形成髓鞘，支持神經突起的生長。正是這兩種特性使得嗅鞘細胞成為神經修復的最佳選擇。已發表的53篇關於嗅鞘細胞移植的文章，也強有力的證明了嗅鞘細胞是神經修復的最佳材料。

嗅鞘細胞被認為是一種可塑性很高的細胞，它可表現出多種細胞形態和細胞表面標誌，在嗅系統發育過程中，嗅鞘細胞根據其在組織定位的不同而有不同的抗原表型，其中P75NTR、GFAP、和O4可標記大部分在體嗅鞘細胞，然而在嗅球外神經層O4陽性嗅鞘細胞仍然可以在P75NTR陽性細胞層內分化成E-NCAM陽性的細胞層，還有一定比率的嗅鞘細胞P75NTR陰性而NY和S100表型為陽性。

體內嗅鞘細胞抗原表型的可塑性決定了其在體外培養形態學和抗原表型的可塑性，已有研究證實純化的嗅鞘細胞能夠分化成兩種不同形態及不同表面標記的細胞，即星型膠質細胞樣嗅鞘細胞和施萬細胞樣嗅鞘細胞。星型膠質細胞樣嗅鞘細胞為扁平狀，表達高水平E-NCAM和GFAP而P75NTR陰性；施萬細胞樣嗅鞘細胞表達P75NTR，部分為GFAP陽性而E-NCAM陰性。這兩種細胞關係並未完全清楚，但是可以肯定它們來源於相同譜系，並且兩著之間是相關的。

OECs的培養，由胚胎、新生期、成年大鼠和小鼠的嗅球取材均已見報道。供體組織年齡的不同，培養細胞的性質也有一定的差異。成熟嗅球從外到內可分為以下幾層：嗅神經層、小球層、外叢層、僧帽細胞層、內叢層、粒層、髓層和室管膜層。嗅球成鞘膠質細胞包繞嗅神經元的軸突經外周部分進入中樞神經系統，終止於嗅球的嗅神經層和小球層。在手術顯微鏡下取嗅球的最外兩層做培養，可以得到含量較高的OECs。Burry等也曾經進行過嗅球神經元體外培養的研究，他們採用機械方法解離嗅球，但是經過這種機械分散方法，細胞破碎較多，細胞活性差。在體外神經元培養過程中採用胰蛋白酶化學消化和機械消化，並在顯微鏡下密切觀察，可以避免消化不充分和過度，使細胞活性提高。

嗅鞘細胞分離有傳統分離法：嗅球置於少量ACSF（人工腦脊液）中(4℃冰浴)，在解剖顯微鏡下，將位於嗅球最外層的嗅神經層、嗅神經及包被的腦膜輕輕剝下，用ACSF洗2次，組織塊用0.125%胰酶(Sigma)37℃消化20min，經胰酶消化的組織塊再移至完全培養液(DMEM：胎牛血清=9：1美國GIBCO公司)中，用滴管輕輕吹打組織塊使之形成細胞懸液備用。分層消化法：整個嗅球置於0.125%胰酶中，37℃消化15min（不時搖動），取出含有細胞的酶液，終止酶反應。剩餘的嗅球再用酶消化，重複以上操作6次，細胞懸液分別收集於6支小試管內備用。直接擠壓法：嗅球置於少量ACSF中，用眼科鑷子直接將嗅球撕爛、擠壓，將剩餘的片狀組織塊轉移至另一試管內，用ACSF洗2次，組織塊用0.125%胰酶（Sigma）37℃消化20min，經胰酶消化的組織塊再移至完全培養液中，用滴管輕輕吹打組織塊使之形成細胞懸液。

傳統分離方法一般分為兩大類，一類是酶消化法，另一類是利用OECs對p75NGFR有特異免疫性的特點，採用免疫抗體包被培養瓶方法、磁珠懸浮法和流式細胞儀分離法將OECs分離。產量上，直接擠壓法最高，傳統分離法次之，分層消化法最低。傳統方法（包括免疫抗體包被培養瓶方法、磁珠懸浮法和流式細胞儀分離法）分離過程複雜，操作時間長，需要特殊儀器及器械，特別是含OECs豐富的嗅神經層非常薄，即使在解剖顯微鏡下也無法與其它組織區別，嗅神經更是難於找到，分離效果很差。直接擠壓法特點是操作簡單易行，省時，不需要特殊儀器設備，且在獲得細胞的數量上略多於傳統分離法。直接擠壓法優於傳統方法和分層消化法。為了加快OECs的增殖速度，提高產量可以在培養液中加入一些促進細胞分裂的物質，如在培養液中加入適量的牛垂體提取物（BPE）可使OECs增殖明顯加快，但因其它細胞增殖也加快，使其純度有所下降。應用Arac純化OECs方法簡便、經濟，OECs純度可達70%左右。時一步純化還可用Thy-1.1抗體殺死成纖維細胞，文獻[13]報道純度可達99%以上，其缺點是方法複雜、費用昂貴。

純化細胞的方法較多，一般有差速貼壁，化學藥物法，梯度離心法，免疫親和吸附法。以後者純化效果最好，其純度可達99%以上，是目前普遍採用的方法之一。但是此法步驟較為繁瑣，費用高，同時細胞經過反覆清洗，活性下降，於是給下一步培養帶來了一定的困難。

主要影響純化的是成纖維細胞，在培養24-48h加入阿糖胞苷，可以有效抑制和殺滅進入分裂期的成纖維細胞，但OECs也受到一定程度的抑制。使用BPE來促進OECs增殖，第8-16d得到生長狀態良好的OECs，純度可達80%。OECs細胞表面具有特異性的低親和神經營養因子受體（L-NGFR），可以特異性的與LNGFR抗體結合，為免疫純化提供了基礎，免疫純化后純度可以提高到98%。為進一步的實驗研究奠定了基礎。

OECs表達膠質纖維酸性蛋白（GFAP），在血管壁形成終足，以及參與形成膠質界膜，此界膜大致勾勒出了嗅神經軸突與嗅球顆粒層嗅小球的交界線，OECs在免疫細胞化學超微結構特徵以及與軸突的功能聯繫方面與星形膠質細胞存在明顯不同。OECs對神經生長因子受體（P75NGR）Laminin細胞粘附分子L1（CAML1）和Vimentin有陽性免疫反應。在體外，OECs對微管相關蛋白2（MAP-2）為免疫反應陰性，而這些抗原是星形膠質細胞的標記物。在電鏡水平，OECs核呈鋸齒狀，染色質分佈不均，高電子密度的胞漿中有微絲散在分佈而星形膠質細胞核呈卵圓形，胞漿電子密度低，中間絲成束分佈在嗅覺傳導路上，OECs成束包裹嗅神經軸突，引導它們穿過PNS與CNS移行區和蛛網膜下腔，進入嗅球體外OECs與神經元共同培養時，它可以包裹神經元軸突形成髓鞘，支持神經突起的生長；而星形膠質細胞在體外對神經元的存活和軸突的生長只有一般的營養作用，不形成髓鞘樣結構。OECs不具有少突膠質細胞的免疫學特徵，雖然它能表達O-2A（少突膠質細胞的標記物），但缺乏其它相關標記物的表達，包括對Rip、抗半乳糖腦苷酯、HNK-1、CD-3等的表達。

OECs有時被稱為嗅覺系統的SCs，但兩者在細胞來源和免疫學特性上明顯不同SCs來源於神經脊細胞，而OECs來源於嗅基板兩者對L1、P75NGR和A5E3均呈陽性免疫反應，不同的是，OECs表達中樞形式的GFAP，SCs不表達；OECs不表達HNK-1和半乳糖腦苷酯，而SCs則均能表達。

OECs可分泌神經營養因子、軸突生長刺激物質，能促進軸突的再生和髓鞘的形成嗅覺系統的免疫組化和原位雜交研究提示OECs不僅可以分泌BDNF、NGF神經營養因子-3（neuortrophinfactor3，NT-3）和NT-4，還能表達Laminin、L1、纖粘連蛋白，S100、膠質源性連接素（Glial-derivednexin）和神經細胞粘附分子（N-CAM）所有這些因子均能支持軸突的延伸。

從第一次嗅鞘細胞的生物學文章發表已經有二十餘年歷史了。1994年RamonCueto和Nieto-Sampedrol發表了第一篇關於嗅鞘細胞有助於感覺軸突長入脊神經切斷術的文章，在此之前Doucette實驗室發表了嗅鞘細胞移植人腦後存活的文章，Raisman小組發現皮質脊髓束損傷後行嗅鞘細胞移植可以使神經功能恢復。從1997年到現在的9年裡有50篇文章是關於嗅鞘細胞移植的；51篇是描述嗅鞘細胞生物學特徵的，還有31篇是綜述性文章，而且大多是和神經修復有關。國內黃紅雲教授率先開展了嗅鞘細胞的臨床試驗，並獲得了滿意的臨床效果。嗅鞘細胞已逐漸引起了科學界的重視，特別是在脊髓損傷修復領域，被認為是治療脊髓損傷最具潛力的細胞。

據美國物理學家組織網2010年11月15日報道，嗅鞘細胞（OECs）是包在嗅覺神經纖維外面起保護作用的被膜，過去25年來，人們一直認為嗅鞘細胞是由鼻內膜形成的，但英國科學家一項新研究顯示，嗅鞘細胞有著不同的起源。

如果將嗅鞘細胞移植到受損的脊髓中，能促進神經修復，支持中樞神經系統再生，這一新發現為治療脊髓損傷提供了更加可靠的資源。該研究由英國維康基金和伊薩克·牛頓基金資助，研究結果發表在本周的美國《國家科學院院刊》上。

理論上講，可以利用病人鼻子中取出的內膜組織，在培養皿中生長出嗅鞘細胞來，然後將其移植到損傷的脊髓中就能促進神經修復，而無需擔心任何排異反應。但這種方法得到的細胞數量太少，不能為治療提供足夠的來源。

論文主要作者、英國劍橋大學發展與神經科學生物系的克雷爾·貝克博士說：“鼻內膜中的嗅鞘細胞太少了，其中還包裹著周邊神經纖維，而這些纖維和嗅鞘細胞非常相似，對促進脊髓修復沒什麼效果。很難從鼻內膜中提純出足夠的嗅鞘細胞，進行有效的移植治療。”

而這項新研究發現，嗅鞘細胞和其他包裹著神經纖維的細胞一樣，源自一種名為神經嵴細胞（neural crest cells）的胚胎幹細胞。為找到嗅鞘細胞的起源，研究人員用綠色熒光蛋白標記了胚胎神經嵴細胞，使其在紫外線照射下可發出綠色熒光。利用基因技術，研究人員在小雞和小鼠的胚胎中移植了綠色熒光蛋白標記的神經嵴細胞，這樣就只有神經嵴細胞及其後代細胞能表達綠色熒光蛋白，可以藉此追蹤神經嵴細胞隨嗅覺神經發育而發生的變化。通過分析胚胎切片，這些具有分子標記的綠色細胞包裹著一束嗅覺神經纖維，也就是說它們確實是嗅鞘細胞。

而成人皮膚和毛囊中都含有神經嵴細胞，這為在實驗室大量培養嗅鞘細胞提供了可能。貝克博士說，下一步需要研究如何把這些幹細胞轉變為嗅鞘細胞，並研究這一過程在胚胎髮育過程中是如何正常開啟的。這可能要花幾年的時間，但我們的發現為大量提純嗅鞘細胞提供新方向。