凝集素

凝集素是動物細胞和植物細胞都能夠合成和分泌的、能與糖結木菠蘿凝集素合的蛋白質,在細胞識別和粘著反應中起重要作用,主要是促進細胞間的粘著。凝集素具有一個以上同糖結合的位點，因此能夠參與細胞的識別和粘著,將不同的細胞聯繫起來。

凝集素（Lectin）是指一種從各種植物，無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白或結合糖的蛋白，因其能凝集紅血球（含血型物質），故名凝集素。其常見種類見表6-1。常用的為植物凝集素（Phytoagglutin, PNA），通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A（Conconvalina,ConA）、麥胚素（Wheat germ agglutinin, WGA）、花生凝集素（Peanut agglutinin, PNA）和大豆凝集素（Soybean agglutinin, SBA）等，凝集素是它們的總稱。凝集素不是來源或參與免疫反應的產物，凝集素具有的某些“親合”特性，能被免疫細胞化學技術方法所應用。因此，Ponder（1983）提出應稱“凝集素組織化學”而不能稱為“凝集素免疫組織化學” 。

雖然人們認為在植物中凝集素的功能是結合細胞表面上的糖蛋白，然而在動物中它的功能也包括結合可溶性的細胞外或細胞內糖蛋白。舉例來說，有一種凝集素被發現在哺乳類動物肝細胞的表面上，能夠專一性的識別乳糖殘基。人們相信這些細胞表面上的接受器是負責將循環系統中的特定糖蛋白移除。另一個例子是甘露糖-6-磷酸接受器能夠識別含有此種殘基的水解酵素，隨後標定這些蛋白將其送至溶小體。它們提供許多不同的生物功能——從細胞附著的調控，到糖蛋白合成，以及血液中蛋白質的濃度。凝集素也能夠藉由識別僅在病原中發現或是無法進入宿主細胞的的糖類而在免疫系統中扮演重要的角色。

植物凝集素

植物凝集素是來源於植物的一類能凝集細胞和沉澱單糖或多糖複合物的非免疫來源的非酶蛋白質。由於其對於單糖或糖複合物特異性結合的能力，使得其在如信號轉導、免疫反應、植物防禦等諸多信號過程中均具有重要作用。同時植物凝集素具有細胞凝集、抗病毒、抗真菌及誘導細胞凋亡或自噬等多種能力，因此在生命科學、醫學及農業方面均有較好的研究價值和應用前景。

凝集素是指非免疫來源的糖結合蛋白或糖蛋白，並應有使細胞凝集或糖複合物沉澱的能力。此定義包含三個要點：(1) 凝集素是蛋白質或糖蛋白；(2) 凝集素必須有專一的與糖基結合的特性，但是排除了免疫來源的針對糖基的抗體；(3) 因為規定了能使細胞凝集或是糖複合物沉澱的特性，所以凝集素分子必須具有兩個或更多糖結合位點，這樣把一些雖有糖結合能力但是糖結合位點僅有一個的酶、轉運蛋白、激素、毒素等排除在外。凝集素可以識別糖蛋白和糖脂中複雜的碳水化合物結構，也識別細胞膜表面的糖基，因此，凝集素可以作為研究細胞膜結構的有利工具。此外，凝集素由於具有多價結合能力，能與熒光素、酶、生物素、鐵蛋白及膠體金等結合而不影響其生物活性，因此，凝集素也可用於免疫細胞化學的研究，以及腫瘤的診斷評價等。凝集素蛋白至少包含一個可以結合碳水化合物的結構域，基於此，凝集素可以被分成主要的四類，部分凝集素(merolectins)、全凝集素 (hololectins)、超凝集素 (superlectin)以及嵌合凝集素 (chimerolectins) 。

純化的凝集素對於臨床應用非常重要，因為它能夠用來鑒定血型。有些存在人類紅血球上的糖脂質以及糖蛋白能夠經通過凝集素來鑒定。一種來自於雙花扁豆（Dolichos biflorus）的凝集素，經鑒定后發現可識別A1血型。來自於植物Ulex europaeus（重瓣刺金雀/荊豆/烏樂樹）的凝集素，經鑒定后發現可識別H血型抗原，而來自於植物Vicia gramineae（野豌豆屬禾本科）的凝集素則可識別N血型抗原。

凝集素在植物中的真正功能還有待研究，而是否僅具細胞附著功能依然還有疑問。凝集素在種子中大量表現（通常自種子中純化），並且隨著植物生長而減少，這顯示其在植物發芽或種子自我生存中扮演了重要角色。

凝集素被視為免疫系統中的直接演化前身，而且它們至今依然在此扮演重要角色 - 凝集素補體激活途徑、甘露糖結合凝集素、S、P、E凝集素,等等。

“高等”凝集素如自然殺手細胞接受器，對於簡單的糖類具有較低的專一性，而對於模糊的寡糖結構顯示高度親和性。

豆科植物中的凝集素已被廣泛的作為模式生物來了解蛋白質如何識別糖類的分子基礎，因為它們相對容易取得而且具有廣泛的糖類種類。許多凝集素的晶體結構也揭示了糖類與蛋白質之間的原子作用。

一個凝集素在生物學上強大的例子是生化戰劑蓖麻毒素。蓖麻毒素是一種由兩個功能結構域所組成而自從蓖麻中純化的蛋白質。其一是一個能夠結合細胞表面上的半乳糖殘基而能夠使蓖麻毒素進入細胞的凝集素，第二個功能結構域是一個能夠將核糖體RNA中的鹼基切除的N-glycosidase，該作用會抑制蛋白質的合成，並進而導致細胞死亡。

一般認為細胞膜上特定的糖基可用以區別細胞的類型和反映細胞在分化、成熟和腫瘤細胞性變中的變化。僅在某些特殊的例子，其細胞結合凝集素的性能可以預先估計，如雙花扁豆素之於血型A物質的特異性，荊豆凝集素之於血型O物質2—L—岩藻糖的特異性，然而在絕大多數情況下，關於由凝集素所識別的碳水化合物決定簇的種類，關於攜帶決定簇的分子的性質和機能，完全憑實驗經驗去發現。

細胞分化標誌：

作為細胞分化和成熟的標記 應用凝集素作為細胞分化的標誌，在這方面的應用報告最多，而且研究比較集中於血細胞，特別是淋巴細胞的分群。如Rose（1980）等發現在小鼠胸腺皮質內不成熟的T淋巴細胞呈PNA陽性反應，在小鼠小腸集合淋巴小結的生髮中心也發現有20%左右的PNA陽性反應細胞，後者是否屬於不成熟的T淋巴細胞，是值得進一步研究的問題。Newman等（1979）以熒光素標記凝集素PNA，發現在大鼠乳腺上皮的不同分化時期顯示不同的熒光強度。在不成熟的大鼠乳腺上皮細胞，熒光弱或無，隨著性成熟期到妊娠期乳腺上皮熒光程度逐漸加強，而泌乳期熒光強度達最高峰。在皮膚角質細胞自基底向表層分化、成熟的過程中，細胞表面的碳水化合物的分佈和性質都在改變。Brabed等（1981）應用新生大鼠皮膚的實驗表明，皮膚各層細胞分別與不同的凝集素相結合。麥芽素與角質化細胞相結合，蓖麻素與棘細胞和基底細胞相結合，而荊豆凝集素標記在棘細胞的表面。在成肌細胞（myeoblast）的分化與成熟過程中，Winaod 和Luzzati（1975）注意到類似的皮膚的改變。

細胞特殊類型標記：

Kivela和Farkkanen（1987）發現在人視網膜，PNA標記視錐細胞而不標記視桿細胞。在乳腺、乳腺上皮細胞呈PNA陽性反應而肌上皮細胞和間質細胞呈PNA陰性反應。以多種凝集素對小鼠、大鼠和兔的腎組織切片進行染色結果表明，刀豆素A和蓖麻素存在於腎臟的各部，PNA和雙花扁豆凝集素（DBA）主要分佈於遠曲小管和集合小管上皮細胞，荊豆凝集素（UEA）主要分佈在血管內皮細胞，而麥芽素分佈在腎小球。應用DBA對RIII和DDK品種的小鼠研究表明，DBA主要結合在各種組織內毛細血

管內皮細胞上，電鏡觀察顯示DBA結合在內皮細胞的表面，在趣的是在RIII品系小鼠某些組織的內皮細胞顯示肯定的DBA陰性反應，說明同一種屬動物的血管內皮細胞也存在有組織特異性的差別。Streit和Kreutzberg（1987）發現Griffonia Simplicifolia凝集素特異性標記面神經節內的小膠質細胞，其它類型的膠質細胞如星狀膠質細胞（astrocyte）等都顯示陰性反應。在切斷面神經后，增殖的小膠質細胞對Griffonia Simplicifolia凝集素的反應加強，免疫電鏡觀察表明，凝集素主要沉積在細胞膜或小膠質細胞突起的軸膜表面，特異性結合糖基是α—D—半乳糖。上海醫科大學附屬腫瘤醫院免疫病理室應用12種凝集素（表6-1）對人胚胎及各種正常組織進行了系統的凝集素受體的定位研究，結果表明，凝集素受體的分佈並無即定規律可尋。如胃粘膜主細胞為PNA受體，而壁細胞為BSL受體，雙花扁豆受體（DBA）主要出現在大腸部份。

伴有細胞膜的改變：

在腫瘤中凝集素結合的改變 腫瘤細胞伴有細胞膜的改變，細胞膜上的糖基也會產生相應的變化，可用凝集素檢測出來。大量研究發現，凝集素可作為腫瘤組織源性的標記、腫瘤特異性診斷的標誌、腫瘤惡性的標記和不同腫瘤的分化標記。如張華忠等（1987）報道115例胃癌標記PHA陽性率高達90.43%，而正常胃粘膜基本是陰性，故認為PHA是胃癌的診斷性標誌。BSA對乳腺惡性腫瘤陽性率達79%，而對良性病變均呈陰性反應，提示BSA可能為乳腺惡性腫瘤的相關標誌。凝集素還有助於判別腫瘤的組織類型，如神經系統星形細胞瘤ConA陽性，小膠質細胞瘤陰性，腎腺癌UEA1陰性，透明細胞癌陽性。

凝集素可為熒光素、酶和生物素等所標記，分別進行下列染色法：

標記物直接標記在凝集素上，使之直接與切片中的相應糖蛋白或糖脂相結合。

（1）切片脫蠟至水。

（2）凝集素標記物（100μg/ml），室溫，30min。

（3）TBS洗3次，每次2min。

（4）如為熒光素標記物，封片用熒光顯微鏡觀察。如為酶標記物，則應依次進行呈色、脫水、透明和封固后在光學顯微下觀察。

直接法的優點是簡便，商品用的凝集素藥盒已能購得。但靈敏性不夠高。

將凝集素直接與切片中的相應糖基結合，而將標記物結合在抗凝集素

抗體上。

（1）脫蠟至水。

（2）用含3%的H2O2的甲醇阻斷內源性過氧化物酶10min。

（3）凝集素稀釋液（100μg/ml）孵育30min。

（4）TBS洗3次，每次2min。

（5）用標記了的抗凝集素抗體（1：100）孵育30min。

（6）TBS洗3次，每次2min。

（7）呈色、脫水、透明、封片。

（8）觀察。

間接法染色還可進一步改良為：①三步法：即在凝集素孵育后，接著用抗凝集素抗體孵育，再用標記了的抗-抗凝集素抗體孵育，層層放大，進一步提高其敏感性，PAP複合物也可作為標記物標記在抗-抗凝集素抗體上。②抗生物素—生物素凝集素法：用結合了生物素的凝集素孵育切片后，TBS洗后再以抗生物素—標記物與之結合。間接法較直接法和直接法敏感性高5～10倍或更多一些，但必須購買或自製抗凝集素抗體。

糖—凝集素—糖法：

本法是利用過量的凝集素與組織切片中特定的糖基相結合。經沖洗后，凝集素上還存在未被佔用的結合部位，將這些部位與有過氧化物酶標記的特異性糖基相結合，形成一個三明治樣的糖—凝集素—糖的結合物。

（1）脫蠟至水。

（2）用含3%的H2O2的甲醇阻斷內源性過氧化物酶10min。

（3）用100μg/ml的凝集素孵育30min。

（4）TBS洗3次，每次3min。

（5）用100μg/mlHRP標記的糖液孵育30min。

（6）TBS洗3次，每次3min。

（7）DAB呈色、脫水、透明、封固。

本法特異性強，靈敏度高，因為這不象生物素—抗生物素法那樣要改變凝集素，又不需要像抗體那樣要製備抗體。HRP本身含有甘露糖，能與刀豆凝集素A、扁豆凝集素和豌豆凝集素結合。但對其它的凝集素，本法目前普及還有一定困難，因為要將過氧化物酶結合到其它凝集素上，就需要將一個適當的碳水化合物基團嵌入過氧化物酶，稱為糖基化（glycosylation），方法雖不複雜（Lee 等1976），但需一定的試劑和設備。商品化能提供的糖基化過氧化物酶品種尚有限。