內標

用於定量計算的參比物測得值

內標即內部標準之意，指在定量分析中添加於檢材內的一種適當的化合物純品，其測得值是計算被測組分含量的參比依據。在毒（葯）物分析中，為了保證操作符合檢測方法的要求，常常選擇一種適當的化合物純品作為隨行參比物，添加已知量於檢材中，跟隨被測組分-起進行前處理，最後同時分別檢測被測組分和參比物，根據參比物的回收情況判斷前處理過程的效率及儀器等檢測條件是否正常。若發現參比物回收率過低或已失蹤，則說明檢測過程存在失誤。當參比物的測得值用於定量計算時則稱為內標，所用方法稱為內標法。

1意義 2影響

意義

1．幾種傳統定量PCR方法簡介：

1）內參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒游標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由於內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板。

2）競爭法：選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒游標記）。擴增後用內切酶消化PCR產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產物分開，分別測定熒光強度，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。

3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的。

2．內標在傳統定量中的作用由於傳統定量方法都是終點檢測，即PCR到達平台期後進行檢測，而PCR經過對數期擴增到達平台期時，檢測重現性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重複實驗，所得結果有很大差異，因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。加入內標后，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

影響

1．實時熒光定量PCR無需內標實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，並記錄在電腦軟體之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：

1）Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恆定的

2）Ct值與起始模板的線性關係由於Ct值與起始模板的對數存在線性關係，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種採用外標準曲線定量的方法。

2．內標對實時熒光定量PCR的影響

若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則PCR反應變為雙重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為顯著。但由於待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個原因，傳統定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。

美國Texas大學的科研人員進行了外標法定量和內標法定量的方法學比較，得出的結論是：內標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方。

AppliedBiosystems公司的7700型實時熒光定量PCR儀是全球公認的熒光定量PCR的金標準，可實現多色熒光同時檢測，但定量檢測仍然採用外標準曲線的方法，而不用內標進行定量。

綜上所述，利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用於基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。

內標

用於定量計算的參比物測得值

意義

影響

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