蛋白晶元
蛋白晶元
蛋白晶元是一種高通量監測系統,通過靶分子和捕捉分子相互作用來監測蛋白分子之間的相互作用。捕獲分子一般都預固定在晶元表面,由於抗體的高度特異性和與抗原強結合特性所以被廣泛的用做捕獲分子。對於研究蛋白晶元的研究在晶元表面有效固定抗體是非常關鍵的,特別是在固定抗體一致性方面非常關鍵對於增強蛋白晶元的靈敏度。
G蛋白是一種抗體結合蛋白,他特意結合抗體FC片段,因此已被廣泛的用於固定不同類型的抗體。
蛋白陣列(protein arrays)主要有兩種形式:一種是抗體陣列(antibody arrays),利用陣列上的抗體識別樣品中的蛋白或其他分子;另一種則是我們今天要談到的靶蛋白陣列(target protein arrays),通過陣列上的蛋白檢測這些我們感興趣的蛋白和其他分子,如藥物、抗體、核酸、脂類或其他蛋白的作用。由於有高通量的優點,蛋白陣列是研究蛋白功能的好工具。
它的基本原理是將各種蛋白質有序地固定於載玻片等各種介質載體上成為檢測的晶元,然後,用標記了有特定熒光物質的抗體與晶元作用,與晶元上的蛋白質相匹配的抗體將與其對應的蛋白質結合,抗體上的熒光將指示對應的蛋白質及其表達數量。在將未與晶元上的蛋白質互補結合的抗體洗去之後利用熒光掃描儀或激光共聚掃描技術,測定晶元上各點的熒光強度,通過熒光強度分析蛋白質與蛋白之間相互作用的關係,由此達到測定各種基因表達功能的目的。為了實現這個目的,首先必須通過一定的方法將蛋白質固定於合適的載體上,同時能夠維持蛋白質天然構象,也就是必須防止其變性以維持其原有的特定生物的活性。
另外,由於生物細胞中蛋白質的多樣性和功能的複雜性,開發和建立具有多功能樣品處理能力、能夠進行快速分析的高通量蛋白晶元技術將有利於簡化和加快蛋白質功能研究的進展。
在功能基因組時代,為了揭示生命活動的規律,蛋白質研究是必然的發展方向面對動態的多因素的生命活動時,識別和檢測蛋白質以及認識其生理功能是非常艱巨的和繁重的工作。
液相晶元體系由許多不同的小球體為主要基質構成,每種小球體上固定有不同的探針分子,將這些小球體懸浮於一個液相體系中,就構成了一個液相蛋白質晶元系統,利用這個系統,我們可以對同一個樣品中的多個不同的分子同時進行檢測,這種檢測技術我們稱之為xMAP(flexible Multi-Analyte Profiling) 技術。
在液相系統中,為了區分不同的探針,每一種用於標記探針的球形基質都帶有一個獨特的色彩編號。在球形基質的製造過程當中,摻入了兩種不同的紅色分類熒光,根據這兩種紅色分類熒光的比例不同,可以把球形基質分為100種。利用這100種球形基質,可以標記上100種不同的探針分子,同時對一個樣本中的100種不同的目的分子進行檢測。
為了便於探針分子的固定,在球形基質的表面進行了一系列的修飾,可適合各種蛋白,肽,核酸等生物分子的固定
球形基質,探針分子,被檢測物,報告分子是液相蛋白晶元的4個主要構成部分。
1)探針分子的固定,
2)將這種標記好探針的球形基質與樣品反應。探針可以與相應的目的分子特異性的結合,帶有綠色報告熒光的報告分子也與目的分子特異性的結合,對反應進行定量。
3)反應結果的檢測
蛋白組學研究是即基因組學研究后的生命科學發展的一個大方向之一。蛋白質的結構和功能最終直接影響著生命活動的變化,基因轉錄水平的研究只能在一定程度上反映基因表達產物的變化,而真正發揮功能的蛋白要經過轉錄后加工、翻譯調控以及翻譯后加工等許多步驟和調控才能形成,因而對蛋白質的直接研究才能真實的解釋各種生命現象。但是研究蛋白質的手段和方法還沒有很大的發展,所以尋找有效、快捷的蛋白分析技術成為了至關重要的一個環節。
蛋白晶元技術的出現給蛋白組學研究帶來新思路。蛋白組學研究中一個主要的內容就是要研究在不同生理狀態或病理狀態下蛋白水平的量變,微型化,集成化,高通量化的抗體晶元就是一個非常好的研究工具,它也是蛋白晶元中發展最快的晶元,而且在技術上已經日益成熟。這些抗體晶元有的已經在向臨床應用上發展,比如腫瘤標誌物抗體晶元等,還有很多已經用在研究的各個領域裡。
第一張抗體晶元由美籍華人Ruo-Pan Huang(黃若磐)博士於2001年在美國發明。該蛋白晶元是一張用於研究的晶元,可以檢測血清樣本中的24種重要的細胞因子。隨後,Ruo-Pan Huang博士創辦了世界上首家專門研發和商品化抗體晶元的公司Raybiotech,向全世界的科研工作者提供抗體晶元產品。經過多年的發展,Raybiotech的抗體晶元已經可以一次過定量檢測1000種人類蛋白(貨號:QAH-CAA-X00)。這些蛋白都是細胞結構和功能上十分重要的蛋白,涉及信號傳導、腫瘤、細胞周期調控、細胞結構、細胞凋亡和神經生物學等廣泛的領域。通過這個產品,我們在一次實驗中就能夠定量分析1000種蛋白的表達水平。
Quantibody QAH-CAA-X00上的抗體是經過精心挑選的,每個抗體的結合親和力都經過了實驗測定,從多種抗體來源的克隆中篩選出反應特異性好,交叉反應程度小,信號明顯的抗體,並且還要保證信號與抗原濃度有著良好的線性關係。優化的抗體探針才可以保證反應的特異和靈敏。晶元的檢測是用熒光報告分子,常用的熒光掃描儀都能夠完成。
第一代的蛋白晶元和DNA晶元一樣是作為一種定性分析的工具,可用於分析樣品之間相關蛋白的相對表達丰度;還可以作為DNA晶元的補充,用於研究蛋白和基因表達之間的關係。但第二代的蛋白(抗體)晶元已經可以靈敏地定量檢測蛋白的表達水平。作為後基因組時代的一個重要研究工具,對推進蛋白質組的研究有重大的幫助。
Ab Microarray 380抗體晶元並不要求特殊的實驗操作,只要一
蛋白晶元檢測分析實驗
隨晶元試劑盒提供的蛋白抽提/標記緩衝液,是專門為抗體晶元而設計的,非常溫和的去垢劑在能高效抽提膜結合蛋白(相比SDS煮沸法能抽提95%以上的蛋白)的同時能保持蛋白的天然活性(非變性條件),這樣能夠保證抽提的蛋白的溶解性和代表性,保證以後的實驗結果的真實性,和原始材料的一致性。
內源標準化處理可以得到一個內源標準化信噪比(INR),內源標準化處理是指對兩個樣品(A、B)中分別用兩種熒游標記分子(Cy3和Cy5)標記,並交叉與晶元雜交(見圖,A-Cy5和B-Cy3一組,A-Cy3和B-Cy5一組分別和晶元雜交),可以作為消除抗原—抗體結合效率差異的對照,也可以消除潛在的不同熒光分子的標記效率差異。假如Cy5標記效率高於Cy3,單純一個實驗的結果就會有偏差(Cy5標記的樣品信號偏高),用這種雙向交叉反應就可以消除這種偏差。兩晶元雜交結果分別得到兩組Ratio值,通過免費下載的工具就可以自動算出每個抗體抗原的INR值,這就代表在兩個樣品間某個蛋白的相對丰度。這種內源標準化處理可以大大減小樣品分析的偏差。
抗體晶元檢測的結果不是蛋白的絕對含量而是378個目的蛋白在兩個樣品之間的相對丰度。值得注意的是由於抗體抗原結合的差異、標記差異等原因,根據晶元結果信號的強弱判斷同一樣品中兩種不同蛋白的多少是不恰當的。
在多年的蛋白晶元技術的研究過程中,研究者為了尋找合適的物質作為蛋白的載體進行了不懈的探索。例如日本學者Velev利用含有陽離子表面活性劑(HTAB)脂質體作為載體,通過戊二醛作用使其與一種鐵蛋白包裹外殼的成分結合組裝製備成為一種納米水平的裝配體,這種裝配體可以在適當的pH條件下,使鐵蛋白分子進入並固定於包裹外殼內面,形成蛋白質的載體。
Adachi等利用某些固體表面或薄膜覆蓋上含有電解質的薄膜作為載體,可以將膠體蛋白質顆粒成分轉移至薄膜上形成蛋白晶元。Uetz等在分析啤酒酵母基因組序列全長度閱讀框架編碼各種蛋白質的相互作用的過程,使用不同孔數的平板作為載體,建立了約含有6000個酵母轉化株組成的平板蛋白晶元系統,平板上的每一個小孔中含有一個酵母轉化株,可以根據其活性功能區開放閱讀框架的編碼表達生成一種蛋白質,利用這個系統可以用於蛋白質功能的檢測和分析。Arenkov等利用聚丙烯醯胺凝膠板作為支持物,將蛋白樣品置於凝膠上,然後經過電泳分離,使其成為蛋白的陣列用於進一步的研究。哈佛大學蛋白晶元研究中心Gavin等利用製備DNA晶元的高精密度機械手的針狀點樣槍頭在只有顯微鏡載玻片一半大小的玻片上,製備了第一張含有樣品點數為10800的蛋白晶元。
這張晶元用已純化的蛋白,G按每點為1納升的點樣量點樣10799次,另一次用FRB(FK-BR12-rapamycin binding domain of FKBP-rapamycin-associated protein)點樣。為了確保不同分子量的點樣蛋白質都能夠被固定在玻片上,他們首先在玻片表面塗上BSA,然後使用N,N’-二琥珀醯胺碳酸(N,N,-disuccinimidyl carbonate)激活BSA表面的賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸殘基成為BSA-NHS玻片,其作用是促進BSA與點樣蛋白質的結合而使蛋白質被固定於玻片上。
在製備晶元過程中,為了保證被固定在載體上的蛋白質依然保持天然的構象和生物學活性,他們在蛋白質點樣的磷酸鹽緩衝液中加入40%的甘油,以防止因體的蒸發而造成的蛋白質變性。點樣后再經3h的溫浴並將零片浸泡於含有小牛血清蛋白(BSA)的緩衝液中,使晶元表面含有一層小牛血清蛋白,用於封閉與其他蛋白質產生非特異性結合的部位及在表面未參加反應的醛基。
為了檢測晶元的應用,他們用不同熒光抗體分別標記能與蛋白G和FRB特異結合的IgG和FKBP12(12Kd FK506-binding protein)並作用於蛋白晶元,觀察這些蛋白質與蛋白晶元的相互作用,其結果清晰地顯示晶元上的蛋白G和單一的FRB點樣分別被標上藍色和紅色熒光。該實驗研究建立了蛋白質樣品微量點樣技術並使蛋白質固定於載體上時能夠保留原有的構象和生物學活性,這將為今後對蛋白質多樣品的并行研究或快速分析——為製備高通量功能檢測的蛋白晶元奠定了技術基礎。
學者們正在開展有關蛋白晶元技術應用的研究,Holt等利用蛋白晶元技術篩選能夠相互結合的特異抗體抗原成分,他們利用12種表達較強但尚未接觸任何抗原的抗體片段篩選含有27648種人胎腦蛋白的蛋白晶元,從中找出了4組高度特異性的抗原(蛋白)-抗體複合物,其中有3種抗體結合的蛋白質功能未明,但是由於表達水平都較低,說明這種抗原-抗體的結合技術是一種具有較高特異性和敏感性的篩選方法,可以用於高通量篩選分離各種不同的抗體成分,或檢測基因的表達和蛋白分子間的相互作用,這將有助於對某些疾病(包括腫瘤)的發病分子機理的研究,以及協助尋找疾病診斷和治療的靶分子。根據蛋白晶元技術的基本原理,可以將不同的抗體固定於載體上成為抗體蛋白晶元,用於檢測不同組織產生的蛋白質。
Ge在蛋白質的相互作用的研究中,採用了一種通用的蛋白質晶元系統,該系統敏感有效,用途廣泛,可定量測定及重複使用,而且操作簡易。
Gavin等應用蛋白晶元技術觀察代謝過程有關作用物和酶的相互作用關係。他們選擇三對沒的激酶-作用物系統,即依賴3’,5’-磷酸蛋白激酶-Kemptide; 酷蛋白激酶Ⅱ-蛋白質磷酸酶抑制因子2和p42促有絲分裂劑激活蛋白(MAP)激酶(ErK2)-E1K1,首先將各系統的作用物按順序固定於三張BSA-NHS玻片上,分別在有同位素γ-³³P ATP的環境中,與不同蛋白激酶溫浴,然後,玻片經用乳劑處理后可在光鏡下觀察到各種蛋白激酶催化特異的作用物產生磷酸化反應。其結果提示蛋白晶元技術可以應用於作用物與酶相互作用的研究及代謝機制的分析。
Gavin等還在蛋白晶元技術研究過程通過DIG、生物素和合成的六氫吡喧酮胺(即AP1497)等三種具有對應的蛋白受體的小分子特質,研究蛋白的受體蛋白按順序固定的相互作用。他們首先將三種小分子物質的受體蛋白按順序固定於同一載體上並製備成為相同的四張蛋白晶元,將BSA分別用沒的熒光物質(Alexa488、Cy3,或Cy5)標記,並分與DIC、生物素和AP1497三種小分子物質結合成為探針,用每一種具有不同熒游標記的探針作用地晶元,結果只能有能與小分子對應的受體蛋白被標上熒光。上述結果說明使用的熒光劑之間沒有交叉的熒光激發和發光作用,因此,將三種標記探針混合後作用於蛋白晶元,則可使三種不同的受體蛋白同時標記上不同的熒光。研究結果提示蛋白晶元技術對於新葯的發掘是十分有用的,因為它對尋找新葯作用的靶點非常方便。
銘源醫療發展公司擁有專利的多腫瘤標誌物檢測(簡稱“C-12蛋白晶元檢測”)已作為可報銷的臨床檢測被正式列入《上海市醫療服務項目和價格表》(簡
蛋白晶元儀 qstar 質譜儀
根據上海市醫學會組織專家評審會的一致推薦,上海市衛生局根據衛生部發布的《醫療技術臨床應用管理辦法》將C-12 蛋白晶元檢測歸類為“第一類醫療技術”。第一類醫療技術是指“安全性、有效性確切,醫療機構通過常規管理在臨床應用中能確保其安全性、有效性的技術”。此次歸類將C-12 蛋白晶元檢測由傳統的健康篩查拓展至針對腫瘤病人的主流臨床應用。