DNA克隆

一個完整的DNA克隆過程應包括：目的基因的獲取，基因載體的選擇與構建，目的基因與載體的拼接，重組DNA分子導入受體細胞，篩選並無性繁殖含重組分子的受體細胞（轉化子）。

利用重組DNA技術構建嵌合DNA時，欲插入載體DNA的外源DNA片段中即含有我們感興趣的基因或DNA序列—目的基因。目前獲取目的基因大致有如下幾種途徑或來源。

如果已知某種基因的核苷酸序列，或根據某種基因產物的氨基酸序列推導出該多肽編碼基因的核苷酸序列后，再利用DNA合成儀通過化學合成原理合成目的基因。利用該法合成的基因有人生長激素釋放抑制因子、胰島素原、腦啡肽及干擾素基因等。

分離組織或細胞染色體DNA，利用限制性核酸內切酶將染色體DNA切割成基因水平的許多片段，其中即含有我們感興趣的基因片段。將它們與適當的克隆載體拼接 成重組DNA分子，繼而轉入受體菌擴增，使每個細菌內都攜帶一種重組DNA分子的多個拷貝。不同細菌所包含的重組DNA分子內可能存在不同的染色體DNA 片段，這樣生長的全部細菌所攜帶的各種染色體片段就代表了整個基因組。存在於細菌內、由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合稱基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)。基因組DNA文庫就象圖書館庫存萬卷書一樣，涵蓋了基因組全部基因信息，也包括我們感興趣的基因。建立基因文庫后需要結合適當篩選方法從眾多轉化子菌落中篩選出含有某一基因的菌落，再進行擴增，將重組DNA分離、回收，獲得目的基因的無性繁殖系—克隆。

以mRNA為模板，利用反轉錄酶合成與mRNA互補的DNA(complementary DNA，cDNA)，再複製成雙鏈cDNA片段，與適當載體連接後轉入受菌體，擴增為cDNA文庫(cDNA library)，然後再採用適當方法從cDNA文庫種篩選出目的cDNA。與基因組DNA文庫類似，由總mRNA製作的cDNA文庫包括了細胞全部mRNA信息，自然也含有我們感興趣的編碼cDNA。當前發現的大多數蛋白質的編碼基因幾乎都是這樣分離的。

(polymerasechain reaction，PCR)：目前，採用PCR獲取目的DNA十分廣泛，應用這一技術可以將微量的目的DNA片段在體外擴增100萬倍以上。PCR的基本工作原理是以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5'末端和3'末端相互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留複製的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重複這一過程，即可使目的DNA片段得到擴增。組成PCR反應體系的基本成分包括：模板DNA、特異性引物、 DNA聚合酶（具耐熱性）、dNTP以及含有Mg 的緩衝液。

1）變性——將反應系統加熱至95℃，使模板DNA完全變性成為單鏈，同時引物自身和引物之間存在的局部雙鏈也得以消除；2）退火(anneal)——將溫度 下降至適宜溫度（一般較Tm低5℃）使引物與模板DNA退火結合；3）延伸，將溫度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP為底物催化DNA的合成反應。上述 三個步驟稱為一個循環，新合成的DNA分子繼續做為下一輪合成的模板，經多次循環（25～30次）后即可達到擴增DNA片段的目的。

外 源DNA片段離開染色體是不能複製的。如果將外源DNA連接到複製子上，外源DNA則可做為複製子的一部分在受體細胞中複製。這種複製子就是克隆載體。重組DNA技術中克隆載體的選擇和改進是一項極富技術性的專門工作，目的不同，操作基因的性質不同，載體的選擇和改建方法也不同。

通過不同途徑獲取含目的基因的外源DNA、選擇或改建適當的克隆載體后，下一步工作是如何將外源DNA與載體DNA連接在一起，即DNA的體外重組。這種DNA重組是靠DNA連接酶將外源DNA與載體共價連接的。改建載體、著手進行外源基因與載體連接前，必須結合研究目的及感興趣基因特性，認真設計最終構建的重組體分子。應該說，這是一件技術性極強的工作，除技巧問題，還涉及對重組DNA技術領域深刻的認識。下面僅就連接方式做扼要介紹。

同一限制酶切割位點連接由同一限制性核酸內切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割DNA后產生單鏈突變（5'突出及3'突出）的粘性末端，同時酶切位點附近的DNA序列不影響連接，那麼，當這樣的兩個DNA片段一起退火時，粘性末端單鏈間進行鹼基配對，然後在DNA連接酶催化作用下形成共價結合的重組DNA分子。

不同限制性內切酶位點連接由兩種不同的限制性核酸內切酶切割的DNA片段，具有相同類型的粘性末端，即配伍末端，也可以進行粘性末端連接。例如MboⅠ(GATC)和BamHⅠ(GGATCC)切割DNA后 均可產生5'突出的GATC粘性末端，彼此可互相連接。

DNA連接酶可催化相同和不同限制性核酸內切酶切割的平端之間的連接。原則上講，限制酶切割DNA后產生的平端也屬配伍末端，可彼此相互連接；若產生的粘性末端經特殊酶處理，使單鏈突出處被補齊或削平，變為平端，也可實行平端連接。

同聚物加尾連接是利用同聚物序列，如多聚A與多聚T之間的退火作用完成連接。在末端轉移酶(terminal transferase)作用下，在DNA片段端製造出粘性末端，而後進行粘性末端連接。這是一種人工提高連接效率的方法，也屬於粘性末端連接的一種特殊形式。

對平端DNA片段或載體DNA，可在連接前將磷酸化的接頭(linker)或適當分子連到平端，使產生新的限制性內切酶位點。再用識別新位點的限制性內切酶切除接頭的遠端，產生粘性末端。

外源DNA（含目的DNA）與載體在體外連接成重組DNA分子（嵌合DNA）后，需將其導入受體菌。隨著受體菌的生長、增殖，重組DNA分子也複製、擴增，這一過程即為無性繁殖；篩選出的含目的DNA的重組體分子即為一無性繁殖系或克隆。在選擇適當的受體菌后，經特殊方法處理，使之成感受態細胞 (competent cell)，即具備接受外源DNA的能力。根據重組DNA時所採用的載體性質不同，導入重組DNA分子有轉化(transformation)、轉染(transfection)和感染(infection)等不同手段。

通 過轉化、轉染或感染，重組體DNA分子被導入受體細胞，經適當塗布的培養板培養得到大量轉化子菌落或轉染噬菌斑。由於每一重組體只攜帶某一段外源基因，而 轉化或轉染時每一受體菌又只能接受一個重組體分子，如何將眾多的轉化菌落或轉染噬菌斑區分開來，並鑒定哪一菌落或噬菌斑所含重組DNA分子確實帶有目的基 因，這一過程即為篩選或選擇。根據載體體系、宿主細胞特性及外源基因在受體細胞表達情況不同，可採取直接選擇法或非直接選擇法。