流式細胞技術

流式細胞技術（flow cytometry，FCM）是利用流式細胞儀進行的一種單細胞定量分析和分選技術。流式細胞術是單克隆抗體及免疫細胞化學技術、激光和電子計算機科學等高度發展及綜合利用的高技術產物。

流式細胞儀由三部分構成

1.液流系統，包括流動室和液流驅動系統；

2.光學系統，包括激發光源和光束收集系統；

3.電子系統，包括光電轉換器和數據處理系統。流式細胞儀的工作原理是使懸浮在液體中分散的經熒游標記的細胞或微粒逐個通過樣品池，同時由熒光探測器捕獲熒光信號並轉換成分別代表前向散射角、側向散射角和不同熒光強度的電脈衝信號，經計算機處理形成相應的點圖，直方圖和加三維結構圖像進行分析。

用於FCM的樣本是單細胞懸液，可以是血液、懸浮細胞培養液、各種體液、新鮮實體瘤的單細胞懸液以及石蠟包埋組織的單細胞懸液等。

1.使各種液體和懸浮細胞樣本新鮮，儘快完成樣本製備和檢測；2.針對不同的細胞樣本進行適當洗滌、酶消化或EDTA處理，以清除雜質，使粘附的細胞彼此分離而形成單細胞狀態；3.對新鮮實體瘤組織可選用或聯用酶消化法，機械打散法和化學分散法來獲得足夠數量的單細胞懸液；4.對石蠟包埋組織應先切成若干40-50um厚的蠟片，經二甲苯脫蠟到水后，再用前述方法製備單細胞懸液；5.單細胞懸液的細胞數不應少於10000個。

流式細胞技術的應用：

1.其測定細胞內DNA的變異係數最小，一般在2%以下；

2.能準確地進行DNA倍體分析；

3.藉助於熒光染料進行細胞內蛋白質和核酸的定量研究；

4.快速進行細胞分選和細胞收集；

5.醫學應用：免疫功能研究各種幹細胞的檢測，癌症病人的多葯耐藥性，細胞功能及代謝動力學研究，血小板分析（心血管疾病），流式細胞術與分子生物學研究；

6 應用於外周血內皮細胞測定、調節性T細胞等尖端領域。

流式細胞分析儀臨床用於細胞治療中心在FACSVantage革命化的細胞分選功能基礎上推出的分選增強（Sort Enhanced edition，SE），BD FACSVantage SE，其新功能和新配置通過與標準多激光多熒光系統以及數據處理系統的完美整合，速度更快，功能更強，是當今流式技術的最卓越體現。

當前，臨床流式細胞分析已成為檢驗醫學發展的一個熱點，其發展趨勢主要體現在以下幾個方面。

一．從相對細胞計數到絕對細胞計數

流式細胞分析最大的優點是對混合細胞群體中亞群細胞的計數，如淋巴細胞可依其表面標誌的不同分為T淋巴細胞（CD3+）、B淋巴細胞（CD19+）、NK細胞（CD16+56+/CD3-），T淋巴細胞又可進一步分為輔助/誘導T淋巴細胞（CD3+CD4+CD8-）和抑制/細胞毒T淋巴細胞（CD3+CD4-CD8+）等。這些亞群細胞計數過去多以相對百分比表達結果，由於百分比只能代表每種細胞在混合細胞群體中所佔的比例，並不能體現其在單位體積血液中的絕對數量，而對艾滋病等一些疾病的臨床診斷，有時需要考慮細胞的絕對數量，如患者血液中T輔助/誘導細胞（CD3+CD4+CD8-）的數量<200個/μL，而未發病（僅有HIV感染）者的數量>200個/μL。T淋巴細胞亞群的絕對計數在國外實驗室早已成為常規檢查，但在國內僅有少數實驗室開展。可以預見，隨著幹細胞技術的發展，對造血幹細胞等的絕對數量分析，不久的將來，也將作為常規檢查項目，走出實驗室進入臨床。

流式細胞絕對計數在臨床可開展的項目包括：①淋巴細胞亞群，尤其是T淋巴細胞亞群的絕對計數。②外周血或骨髓中造血干/祖細胞的絕對計數。③血液中網織紅細胞的絕對計數。④血液中血小板數量，尤其是血小板減少症患者血小板的絕對計數，此種計數優於血細胞分析儀法，已成為血小板計數的國際推薦參考方法。此外，可能出現在血液中的其它一些稀少細胞（如內皮細胞、轉移的腫瘤細胞等）的計數，也將發展為流式細胞絕對計數。流式細胞絕對計數的開展對臨床疾病的診斷、治療等有重要意義。

二．從相對定量到絕對定量分析

細胞的多種成分如某些抗原或受體表達的流式細胞分析，以前多以平均熒光強度（MFI）或相對熒光強度（RFI）表達其含量。由於流式細胞儀每次的儀器狀況可出現差異，每個實驗室所用儀器的類型也不盡相同，因此，以MFI或RFI表示細胞抗原或受體的表達量缺乏可比性，雖然流式細胞儀有極高的熒光靈敏度，但卻無法準確應用這些信息。近年來，為了通過FCM精確定量分析細胞的某些成分，定量流式細胞術（Quantitative Flow Cytometry，QFCM）逐漸得到發展，其定量分析原理主要有兩種：①定量抗體微球法：在特製的微球上包被已知分子數的羊抗鼠IgG分子，再將包被不同分子數的微球混合，形成含不同羊抗鼠IgG分子數的混合微球，此微球與待測標本在相同條件下與熒光素標記的單克隆抗體（McAb）反應后在流式細胞儀上測定其熒光強度，根據微球上所包被的羊抗鼠IgG分子數和與之對應的對數熒光強度計算回歸方程，再將待測樣本中陽性細胞的對數熒光強度代入方程即可求得其每個細胞上的平均抗原分子數（抗原結合位點數）。②定量熒光素分子微球法：在特製的微球上直接包被熒光素分子，再將包被不同分子數的微球混合，形成含不同數量熒光素分子的混合微球。在流式細胞儀儀器設置相同的條件下測定此微球及待測細胞的熒光強度，根據微球上所包被的熒光素分子數和與之對應的對數熒光強度計算回歸方程，再將待測樣本陽性細胞的對數熒光強度代入方程，可求得每個細胞上的平均熒光素分子數，根據用於樣本測定的單克隆抗體（McAb）與熒光素結合的分子比例，計算每個細胞上的平均抗原分子數。單細胞的抗原或受體定量是流式細胞分析的重要進展，為細胞的生物學、分子生物學、生物化學及免疫學等研究提供了更精確的方法。例如，白血病原始細胞膜的CD45分子表達量低於正常淋巴細胞，活化血小板膜CD62P、CD41分子數顯著高於靜止血小板，活化淋巴細胞的CD69分子數顯著增高，活化中性粒細胞膜CD64分子數顯著高於靜止中性粒細胞，強直性脊柱炎患者T淋巴細胞膜HLA-B27分子數明顯增高。CD8+T淋巴細胞膜的CD38分子數增高是慢性HIV感染者病情發展或死亡的更有力的預后指標；AIDS治療有效后，CD8+T淋巴細胞CD38分子數顯著降低。

三．從單色到多色熒光分析

流式細胞分析已從最初的間接免疫熒光染色、單色或雙色直接熒光染色，迅速發展到三色、四色甚至五色或六色熒光分析，使得對細胞亞群的識別和分選、細胞功能評價等更為精確。目前，淋巴細胞亞群的分析、白血病免疫表型分析，均應使用至少三色以上的熒光分析才更可靠。例如：輔助/誘導T淋巴細胞四色熒光分析的免疫表型為CD3+CD4+CD8—CD45+，慢性淋巴細胞白血病的異常淋巴細胞的四色免疫表型為CD5+CD10—CD19+CD45+。多色熒光分析是流式細胞技術發展的必然趨勢，有條件時應儘可能地採用。

四．從細胞膜成份到細胞內成份分析

細胞膜免疫表型分析是最重要的流式分析內容之一，很多細胞亞群的檢測和分選均是以細胞膜的免疫表型特徵為依據，如T、B淋巴細胞和NK細胞分析、白血病免疫分型等。然而，僅有膜免疫表型的分析是不夠的，尤其對一些細胞的系列鑒定和功能狀態分析常常較為困難，而細胞漿或細胞核內成份的分析則更能反映某些細胞的系列特徵和功能變化。隨著近年來細胞內成分檢測技術的不斷完善，細胞內成分檢測已成為流式細胞分析的又一個熱點。例如，急性髓系白血病性原始細胞漿中檢測到髓過氧化物酶（MPO）是最為準確的系列標誌，急性B淋巴細胞白血病性原始細胞胞漿中檢測到CD79a是最為特異的系列標誌；檢測T淋巴細胞胞漿內細胞因子合成的種類及含量和膜CD69分子表達，是判斷T淋巴細胞活化及其功能的重要手段，而且還能將輔助/誘導T淋巴細胞（Th）進一步分成Th1和Th2亞類，在Th1和Th2細胞漿中可分別合成γ-干擾素（IFN-γ）、白細胞介素-1（IL-1）和IL-4、IL-5、IL-10。通過細胞內成分檢測技術與多色免疫熒光分析方法相結合，可檢測不同細胞亞群合成的不同細胞因子（Cytokine），如用五色疫熒光分析血液中淋巴細胞經誘導劑刺激后，輔助/誘導T淋巴細胞亞類—Th1細胞內有細胞因子合成的免疫表型為CD3+CD4+CD8—IFN-γ+IL-1+。

五．液體中可溶性成分的流式細胞分析

從傳統意義上講，流式細胞技術只能分析細胞及其成分，液體中的可溶性成分則不能進行分析。然而，如果將液體中的可溶性成分結合在一種類似於細胞大小的顆粒（如乳膠顆粒）上，流式細胞儀便可以對其進行分析，這就是近年來發展起來的流式微球分析（Cytometric Bead Assay，CBA）技術。CBA的原理是將包被某種抗原或抗體不同大小的微球與待測液體中的相應成分反應形成抗原與抗體的複合物，再加入熒光素標記的第二抗體，微球上結合的待測抗原或抗體分子數量與其熒光強度呈線性關係，由此可對待測液體中與微球上包被抗原或抗體分子相對應的成分進行定性或定量分析，例如同時測定血清或細胞培養液中的多種細胞因子，同時測定血清中多種自身抗體。CBA發展的時間雖很短，目前所能檢測的項目還不多，但其發展潛力不容忽視。已知檢測細胞因子的方法有多種，包括靶細胞功能分析法、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、斑點酶免疫分析（Elispots）等，但CBA與之相比，其靈敏度極高、可達2pg/ml，而且能同時測定單個標本中的多種細胞因子。

六．分子表型分析

分子表型分析（Molecular Phenotyping）是指用流式細胞技術檢測細胞中特異性核酸序列或特異性基因異常。流式分子表型分析與免疫表型分析技術相結合，為所選擇細胞亞群的特異性核酸序列（如癌基因、病毒核酸等）檢測提供了一種非常有用的工具，具有廣闊的應用前景。流式分子表型與免疫表型分析結合的基本技術路線是：①待測細胞首先與特異性細胞亞群的單克隆抗體反應，②固定並滲透細胞，③通過PCR進行引物特異的核酸序列擴增，④應用對擴增產物的特異性寡核苷酸熒光素標記探針進行熒光原位雜交（FISH），⑤加入針對細胞亞群單抗的熒光素標記的第二抗體。⑥流式細胞儀檢測及數據分析。例如，流式細胞免疫表型與聚合酶鏈反應及熒光原位雜交（PCR-FISH）結合測定血液CD4+細胞中HIV特異的DNA或RNA，對於AIDS的病程監測、治療反應以及預后等具有重要價值。

流式熒光原位雜交（Flow-FISH）法可測定染色體端粒長度。細胞的染色體端粒是由2~20Kb串聯的短片段重複序列(TTAGGG)n和一些結合蛋白組成，端粒長度越長，所含重複鹼基數目越多；用熒光素標記的核酸-(CCCTAA)3端粒序列特異性探針進行FISH后，端粒的長短可以流式細胞儀檢測到的熒光強度的高低反映出來；Flow-FISH測定精度可小於3Kb的端粒長度差，對腫瘤的發生與發展、治療與預后等的研究有一定價值。