TRIzol

TRIZOL的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白，核酸 物質解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內源和外源RNase（RNA酶）。

TRIZOL是從細胞和組織中提取總RNA的即用型試劑，在樣品裂解或勻漿過程中，TRIZOL能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分為水相和有機相，RNA在水相中。取出水相，用異丙醇可沉澱回收RNA。

※0.1%的8－羥基喹啉可以抑制RNase，與氯仿聯合使用可增強抑制作用。

※異硫氰酸胍屬於解偶劑，是一類強力的蛋白質變性劑，可溶解蛋白質並使蛋白質二級結構消失，導致細胞結構降解，核蛋白迅速與核酸分離。

※β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質中的二硫鍵。

Trizol試劑可以快速提取人、動物、植物、細菌不同組織的總RNA，該方法對少量的組織（50-100 mg）和細胞（5×106）以及大量的組織（≥1 g）和細胞（>107）均有較好的分離效果。TRIZOL試劑操作上的簡單性允許同時處理多個的樣品。所有的操作可以在一小時內完成。TRIZOL抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白的污染。故而能夠作RNA 印跡分析、斑點雜交、poly(A)+ 選擇、體外翻譯、RNA酶保護分析和分子克隆。並且利用DNA、RNA和蛋白質在不同溶液中的溶解性質，可以通過分層分別將不同層中的RNA（上層）、DNA（中層）、蛋白質（下層）分離純化出來，效率極好。

Trizol試劑能促進不同種屬不同分子量大小的多種RNA的析出。例如，從大鼠肝臟抽提的RNA瓊脂糖凝膠電泳並用溴化乙啶染色，可見許多介於7 kb和15 kb之間不連續的高分子量條帶，（mRNA和hnRNA成分）兩條優勢核糖體RNA條帶位於~5 kb （28S）和~2 kb （18S），低分子量RNA介於0.1 和 0.3 kb之間 (tRNA,5S）。當抽提的RNA用TE稀釋時其A260/A280比值≥1.8

該法從細胞中提取RNA——用勻漿器將組織磨碎，加入TRIzol處理組織。5分鐘后加入氯仿，以每分鐘12000轉離心5分鐘，樣品即分成水樣層、中間層和有機層。

※RNA存在於水樣層中，收集水樣層后可以通過異丙醇沉澱RNA來還原。

※在除去水樣層后，中間層中的DNA和蛋白質也能相繼以沉澱的方式還原：乙醇能使中間層的DNA沉澱析出，在中間層中加入異丙醇能沉澱出蛋白質。

每100ml TRIzol可以抽提100個六孔板中的樣品或100個50-80mg的組織樣品。無論樣品是人、動物、植物還是細菌組織，該方法對少量的組織（50-100mg)和細胞（約五百萬個）及大量的組織（≥1g）和細胞（超過一千萬個）均有較好的分離效果。

每一百萬細胞用TRIzol抽提可得5-15微克RNA，每毫克組織用TRIzol抽提可得1-10微克RNA（產量因細胞和組織不同而異）。

TRIzol操作上的簡便性允許其同時處理多個樣品，所有的操作可以在一小時內完成。

TRIzol抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白質的污染，故而能夠作RNA 印跡分析、斑點雜交、poly(A)+ 選擇、體外翻譯、RNA酶保護分析和單分子克隆（PCR）。

※如果是用於PCR，當兩條引物位於單一外顯子內時，建議用級聯擴大的DNase I(Cat. No. 18068）來處理抽提的總RNA。

※TRIzol試劑能促進不同種屬、不同分子量大小的多種RNA的析出。例如，從大鼠肝臟抽提的RNA經過瓊脂糖凝膠電泳並用溴化乙啶染色，可見許多介於7kb和15kb之間的不連續的高分子量條帶（mRNA和hnRNA成分），兩條優勢核糖體RNA條帶位於~5 kb （28S）和~2 kb （18S），低分子量RNA介於0.1和0.3kb之間 (tRNA,5S）。當抽提的RNA用TE稀釋時，其A260/A280比值≥1.8。抽提小RNA時宜-70℃沉澱過夜。

TRIzol對人體有害，使用時應戴一次性手套，注意防止濺出。

⒈樣品的製備 當樣品富含蛋白質，脂肪，多糖或是細胞外物質例如肌肉，脂肪組織和植物的塊莖部分時可能需要一額外的分離步驟。勻漿化后在2—8°C的條件下以12,000×g的離心力離心10分鐘，移除勻漿中不溶解的物質，餘下的沉澱中包含有細胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，而上層的超浮遊物含有RNA。在來自於脂肪組織的樣品中，大量的脂肪漂在最上層因而應該除掉。在每一個個案中，將清亮的勻漿溶液轉移到一乾淨的試管中加入氯仿並繼續進行下述的分離步驟。

⒉ 分離階段 將勻漿樣品在15—30°C條件下孵育5分鐘以使核蛋白體完全分解。每1 ml TRIZOL加0.2 ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒並將其在30°C下孵育2—3分鐘。在2—8°C下以不超過12,000×g的離心力高速冷凍離心15分鐘。離心后混合物分成三層：下層紅色的苯酚-氯仿層，中間層，上層無色的水樣層。RNA無一例外地存在於水樣層當中。水樣層的容量大約為所加TRIZOL容量的60%。

⒊ RNA的沉澱 將水樣層轉移到一乾淨的試管中，如果希望分離DNA和蛋白，有機層同樣要予以保留。通過將水樣層和異丙醇混合來沉澱RNA。最初均化時的每1 ml TRIZOL對應0.5 ml異丙醇。將混合的樣品在15—30°C條件下孵育10分鐘並在2—8°C下以不超過12,000×g的離心力高速冷凍離心10分鐘。RNA沉澱在離心前通常不可見，形成一膠狀片狀沉澱附著於試管壁和管底。

4 .RNA的洗脫 移去上層懸液。用75%的乙醇洗滌RNA沉澱一次，每1 ml的 TRIZOL至少加1 ml的75%乙醇。旋渦振蕩混合樣品並在2—8°C下以不超過7,500×g的離心力高速冷凍離心5分鐘。

⒌ RNA的再溶解 在操作的最後，簡單幹燥RNA沉澱（空氣乾燥或真空乾燥5—10分鐘）不要在真空管里離心乾燥RNA。尤為重要的是，不能讓RNA沉澱完全乾燥那樣會極大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA樣品其A260/280比值< 1.6。用移液管尖分幾次移取無RNA酶的水或0.5% SDS溶液來溶解RNA，並在55—60°C下孵育10分鐘（當RNA以後要用於酶切反應時，避免使用SDS。）RNA還能被100%甲醯胺（除去離子）再溶解並保存在–70°C。

RNA抽提注意事項

⒈從少量的組織（1—10 mg）或細胞（102—104）中分離RNA 樣品：往組織或細胞中加入800 µl TRIZOL。待樣品裂解后，加入氯仿並進行步驟2中的抽提操作。在用異丙醇沉澱RNA之前，加入5—10μg無RNA酶的脂質體(CatNo 10814）作為水樣層的載體。為降低其黏度在加入氯仿前用26號注射器抽吸兩次以切斷基因組DNA。脂質體會留在水樣層中並和RNA共析出。在濃縮到4 mg/ml之前它不會抑制第一絲狀體的合成也不會抑制PCR。

⒉在勻化后和加入氯仿之前，樣品可以在–60—–70°C保存至少一個月。RNA沉澱（步驟4，RNA洗脫）溶於75%的乙醇在2—8°C至少可以保存一周，在–5—–20°C下至少可保存一年。

⒊台式離心機最大能達到2,600×g的離心力，如果將離心時間延長到30-60分鐘可以滿足步驟2和步驟3中的操作。

在2000ml的燒杯中加入以下物質，混合均勻：

500ml重蒸苯酚；

250g異硫氰酸胍；

293mL蒸餾水；

⒘6mL 0.75M 檸檬酸鈉溶液（pH≥7）

26.4mL 10%sarcosy（十二烷基肌氨酸鈉）溶液

50mL 2M NaAc溶液（pH≥4）

TRIzol需4℃低溫保存，保質期約一年。100mL TRIzol試劑市場售價約478元人民幣。

註釋：⑴水和苯酚部分互溶，Trizol中苯酚被水飽和，形成均勻溶液；⑵NaAc等鹽類的作用是提供緩衝環境。

互溶，Trizol中苯酚被水飽和，形成均勻溶液；⑵