透明顫菌血紅蛋白
透明顫菌血紅蛋白
透明顫菌血紅蛋白是一個醫學名詞,指氧傳遞直接或間接影響著需氧生物的初級代謝和次級代謝。
透明顫菌血紅蛋白Vitreoscilla hemoglobin
氧傳遞直接或間接影響著需氧生物的初級代謝和次級代謝。在哺乳動物中,血紅蛋白具有氧結合特性,過去曾認為這種氧結合蛋白只存在於哺乳動物中,近期發現,它幾乎普遍存在於動物、植物和微生物中。透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla hemoglobin, VHb)是由透明顫菌屬(Vitreoscilla sp. C1)中產生的一種可溶性血紅蛋白,這種血紅蛋白能在貧氧條件下被大量誘導合成,使透明顫菌在微氧條件下能夠很好地生存。隨著研究的深入,發現該基因的表達在轉錄水平上受氧濃度調控。因此在以溶氧為限制條件的生物反應器中,尤其是在大規模、高密度微生物發酵和動植物細胞培養解決供氧問題領域具有潛在的應用前景。
透明顫菌是一種專性好氧的革蘭氏陰性絲狀菌,屬於貝日阿托氏菌屬(Beggiatoe),在沼澤、腐爛植物等貧氧的環境中生長旺盛。VHb在透明顫菌中被發現,最初被認為是“細胞色素o(cytochrome o, CYO)”蛋白,具有末端氧化酶的性質。Cyo在不同的環境條件下可呈現三種不同的狀態,即氧化態、還原態、氧合態,並可以相互轉化;其中還原態是生理活性態,而氧合態則是富氧條件下的表現形式。它在577、544和420 nm處有最大吸收峰,若向溶液中鼓入CO氣體,則可形成蛋白?CO複合物,在566、535及419 nm處呈現特徵吸收峰。但是隨著1983年真正的Cyo的分離和確定,實驗表明該蛋白在光譜學和氧結合動力學性質上與氧合肌紅、血紅蛋白相似。1986年,Wakabayashi等結合蛋白質初級結構、光譜性質、氧結合動力學確定了該蛋白的結構,並將該蛋白正式命名為透明顫菌血紅蛋白。
VHb為同型二聚體,帶有兩個相對分子量為15 775的亞基,每個亞基含有146個氨基酸殘基和兩個b型血紅素。完整的VHb是可溶性的,但是脫去血紅素輔基便不可溶。序列分析表明,VHb與其它真核生物蛋白氨基酸有明顯的同源性,其中與黃羽扇豆血紅蛋白(Yellow lupin LegHb)的同源性最高,達到24%。真核生物的血紅蛋白形成8個α螺旋區(A、B、C、D、E、F、G和H),而VHb每個亞基形成6個α螺旋區(A、B、E、F、G和H)。X射線晶體學表明VHb在近端和遠端有獨特的血紅素端囊,初步認為受E螺旋和F螺旋的干擾所致,通過氫鍵和TyrB10、GlnE7、ProE8及LysE11四個殘基形成此結構。大多數種類的血紅蛋白都有一個末端的His(E7)殘基,該His殘基通常通過氫鍵與氧結合。而VHb端囊的E7位置為Gln殘基。定點突變表明,GlnE7 His突變對VHb立體結構影響很大,野生型VHb解離常數比GlnE7 His突變型蛋白大很多,因此,VHb與被束縛的氧親和力小,從而使氧的傳遞速度更快,這與晶體學研究結果一致。而在N端存在某些結構差異,少了α?螺旋,這段序列曾被認為可能是前導肽,影響VHb的分佈,使活性VHb主要分佈在細胞周質。近期用電子顯微鏡對VHb在透明顫菌和大腸桿菌中分佈的分析結果表明,VHb主要分佈在細胞質中而不是細胞周質,作者還認為細胞周質中的VHb可能是VHb過量表達而被擠出的結果。
20世紀80年代中期以前,學者們一直認為,可溶性Cyo在細胞呼吸中作為一種終端氧化酶而起作用。1986年,Orii等對VHb與O2及VHb與CO結合的動力學進行了討論,指出VHb可能是作為O2載體和儲存物而起作用的。1988年,Dikshit等根據已報道的VHb氨基酸序列合成探針,與透明顫菌基因組DNA進行雜交,在透明顫菌血紅蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene, vgb)可能位區,得到了含有vgb基因的1.4 kb的DNA片段,且此vgb基因攜帶內啟動子而不受載體啟動子的控制;同年,Khosla等也用類似方法克隆了vgb基因,在vgb重組大腸桿菌中表達時,同樣得出了vgb基因是以自身啟動子啟動表達的結論。他們還測定了vgb基因的核苷酸序列,結果與Wakabayashi報道的VHb氨基酸序列十分吻合。
將vgb基因轉入大腸桿菌中表達,VHb的量與環境中的氧含量有關,vgb基因啟動子在微氧條件下(小於2%大氣飽和度)被誘導。將vgb基因啟動子與氯黴素乙醯轉移酶和兒茶酚雙加氧酶等報告基因融合併轉入大腸桿菌中表達,發現在低氧條件(5%)下的報告基因產物比高氧條件(20%)下多5~7倍,說明vgb基因啟動子的活性受氧濃度的調控。當去掉啟動子的vgb基因和大腸桿菌tac啟動子融合后,其表達不再受氧調控而異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside,IPTG)可以增加表達。vgb基因在大腸桿菌和透明顫菌中表達條件相似,都隨溶氧水平下降而表達水平升高。光譜分析表明,重組大腸桿菌表達的VHb的存在狀態與透明顫菌中表達的VHb的存在狀態相一致:在富氧條件下呈氧合態,而缺氧條件下呈現生理活性的還原態。溶氧並非直接作用於vgb基因啟動子上,而是由鐵氧還蛋白?NADP還原酶(ferredoxin?NADP reductase, FNR)或環腺苷酸受體蛋白質(cyclic AMP receptor protein,CRP)相關蛋白作為轉錄激活因子正向調控vgb基因表達。其中vgb基因啟動子區域同大腸桿菌lac啟動子CRP結合位點有極高的同源性。FNR蛋白是細菌應答厭氧環境的一個調控子,屬於螺旋?轉折?螺旋結構的DNA序列的結合蛋白,並且富含半胱氨酸,形成半胱氨酸口袋結構,能與Fe2+和Fe3+參與細胞對氧的應答。FNR調控系統是通過FNR蛋白在限氧條件下對厭氧基因的激活來應答環境信號的。在缺乏fnr的大腸桿菌突變體中,vgb啟動子在貧氧條件表達產物減少了一半,這表明在調節vgb啟動子活性中存在著FNR或FNR樣蛋白質。另外Khosla等認為培養基中的氮源(例如酵母提取物)能抑制vgb啟動子的表達,具體機制目前仍不清楚。
目前,透明顫菌血紅蛋白使細菌在低氧條件下能夠很好生存的生理功能尚不完全清楚,各國科學家對vgb基因進行了細胞定位、表達調控以及該血紅蛋白對能量代謝和呼吸鏈影響等多方面的研究。
Kallio等提出了兩種假設:易化擴散假說和氧化還原效應假說。易化擴散假說認為VHb與氧結合增加了氧在細胞周質空間的傳遞量。Khosla和Bailey發現大腸桿菌中表達的VHb有35%~45%分佈在周質空間。VHb蛋白N端功能域具有弱輸送前導肽的功能,從而使VHb分佈在細胞周質空間和細胞質內,支持了易化擴散假說。氧化還原效應假說認為氧合透明顫菌血紅蛋白可能影響了細胞內一些關鍵的氧化還原敏感分子的活性,可能是呼吸鏈上的某個關鍵酶,該影響可引起能量代謝效率的提高。
吳奕等提出了另一種假說即末端電子受體假說,認為氧合態VHb作為末端電子受體參與大腸桿菌呼吸鏈末端氧化過程,他們還依據這一假說定量研究了VHb對大腸桿菌能量代謝的影響。研究表明,VHb在微氧代謝狀態時的表達大大提高了呼吸鏈末端電子受體量,促進電子傳遞過程轉向能量代謝效率較高的Cyo途徑,從而使細胞適應貧氧的生活環境。
VHb對生長的促進作用在有細胞色素o而無細胞色素d的突變體中比在有細胞色素d而無細胞色素o的突變體中更加顯著。VHb增加了這兩種末端氧化酶(尤其是細胞色素o)的含量並提高它們的活力。低氧條件下,VHb的存在使更多的葡萄糖轉向磷酸戊糖途徑代謝,而向三羧酸循環的碳源減少,總的ATP產量加大,而底物水平磷酸化產生的ATP減少。VHb還增加大腸桿菌吸收氧的速率,但細胞中的NAD(P)H含量減小。說明VHb提高了電子傳遞鏈的周轉率。
VHb在大腸桿菌中的表達明顯促進了微氧條件下細胞的生長狀況和蛋白質合成的能力。Khosla等分析了VHb表達前後菌體蛋白的組成,蛋白質的種類沒有改變;從產生效應的時間來看VHb的功能是由其本身所引起,而不是細胞在基因水平的二次應答。
儘管VHb的作用機制還需要進一步研究,但用光譜分析方法發現VHb蛋白可與氧結合成穩定的氧合態,氧合態的形成是VHb發揮生理功能的必需條件。多數證據顯示,以這種氧合態的形式介入細胞與氧的代謝途徑,最終影響某些基因的表達。