VLPs

多種病毒如人和動物的免疫缺陷病毒、人乳頭狀瘤病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒和漢坦病毒等的結構蛋白都能在各種不同的表達系統中自動組裝成病毒樣顆粒, 顆粒大小一般在20～150 nm之間。由於VLPs表面能夠重複且高密度展示外源性表位從而引發強有力的免疫應答, 因此它對於多種疾病來說都是一種可開發理想的疫苗形式。最近, 倍受疫苗研究者關注的是, Merck公司研製的HPV6、 11、 16、 18四價VLP Gardasil疫苗已經在2006年6月獲得美國FDA許可且已投放市場, 它被認為是上天對女性的恩賜[1]。由此, 人們對以VLPs為基礎的疫苗研究更加熱衷。現就基於VLP的疫苗研究情況進行綜述。

1 VLPs的形成

有些病毒樣顆粒與天然形成的亞病毒顆粒（SVPs）相似。例如, 在酵母和哺乳動物細胞中表達的乙肝病毒小包膜蛋白形成22 nm大小的VLPs, 與在HBV感染患者血液中發現的天然產物SVPs相同。值得一提的是, 這些血漿來源的SVPs也就是之後的第1代HBV疫苗[2]。同樣人乳頭狀瘤病毒的L1蛋白組裝成的VLPs與病毒複製時形成的空病毒顆粒相似, 只是天然形成的空病毒顆粒還包含L2蛋白, 目前基於HPV L1蛋白的重組人乳頭瘤病毒疫苗已取得執照並得到應用[1, 3]。另外, 有些嵌合型病毒樣顆粒也可以提呈外源性表位和分子。這可以通過改變VLPs的基因序列來實現, 比如說通過從頭合成的方式將VLP蛋白和外源性蛋白組合到一起。這方面最早的例子就是將一段肽序列連接到乙肝病毒核心抗原（HBcAg）上[4]。此外, 我們還可以通過化學結合的方式得到VLPs。通常情況下, 插入外源性基因序列或表位並不影響顆粒的形成和它的免疫原性。

但是, 一些病毒在形成VLPs的過程中也存在許多障礙。例如無包膜病毒（如HPV）, 有包膜病毒（如HBcAg）在自動組裝過程中需要表達一個或多個殼蛋白, 這就需要它們的正確組裝以形成顆粒結構[5]。如HBc分子核殼可分別由240、 180個相同的亞單位裝配成為大小分別為34 nm、 30 nm的核心顆粒, 分別形成T=4、 T=3的正二十面體對稱結構, 在其表面有刺突結構, 被稱為MIR區, 是插入外源表位的最佳位置。這些殼蛋白可能是由一個前體蛋白加工而來, 也可能是一個細胞共表達多個殼蛋白[6]。有些病毒在細胞內自組裝成VLPs后以出芽的形式釋放出來, 它們包含有細胞的脂質, 從而形成了病毒的脂蛋白包膜。

多種表達系統都可產生VLPs, 包括哺乳動物細胞表達系統, 桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統, 酵母表達系統及大腸桿菌等原核表達系統。酵母表達系統由於能夠大量生產, 成本低, 表達容易使得它應用廣泛, 但是蛋白的糖基化, 正確摺疊, 及包裝, 以及密碼子的優化等都是選擇表達系統時需要考慮的問題。大腸桿菌表達系統不允許蛋白糖基化, 酵母和桿狀病毒表達系統對於甘露糖蛋白的修飾有限制作用。而通過桿狀病毒表達系統包裝的流感病毒VLPs由於與桿狀病毒的顆粒大小相似, 都是80～120 nm從而很難分離。哺乳動物細胞表達系統對於蛋白表達后的加工修飾和正確摺疊能起到作用, 但是它不易人為控制而且花費高, 所以應用受到了限制。

2 VLPs的免疫原性

2.1 VLPs誘導體液免疫應答 VLPs在通常情況下比亞單位疫苗和重組的蛋白疫苗有更強的免疫原性, 能夠刺激機體免疫系統產生很強的免疫應答。與天然病毒一樣, VLPs的空間結構允許它展示抗原決定表位, 因此能夠刺激機體產生中和抗體。機體對於VLPs呈現在其表面的抗原可以通過一種安全有效的方式誘導產生抗體, 在這方面可溶性抗原是望塵莫及的。一種新型戊型肝炎病毒VLPs免疫小鼠后能夠有效的誘導小鼠產生特異性的HEV抗體, 並且隨著免疫次數的增加抗體水平逐漸升高並至少可以持續3個月[7]。經乳頭瘤病毒(PV)VLPs免疫的多種動物的血清中可檢測到高滴度血清中和抗體, 後者能保護動物抵抗大劑量乳頭瘤病毒的實驗性攻擊。另有試驗證實用HPV?VLPs經陰道免疫雌性小鼠后能檢測到高滴度的陰道分泌性IgA 及血清IgG[8]。Gardasil和Cervarix疫苗Ⅲ期臨床試驗免疫后的女性體內產生高滴度的中和抗體, 對女性HPV感染及HPV相關性宮頸上皮非典型增生可起到有效的保護作用[1]。

2.2 VLPs誘導固有和適應性免疫應答 一般認為, VLPs在沒有任何佐劑的情況下就可誘導較強的免疫應答, VLPs本身具有的佐劑效應是因為它們的大小適合被樹突狀細胞（DCs）攝取, 其高效攝取VLPs的可能機制包括: 吞噬、滲透及TLR受體介導等。經過加工處理后的抗原可以被MHC?Ⅱ類分子提呈, 促進DCs的成熟和遷移, 這個過程對激活固有免疫系統是十分重要的。外源的VLPs也能通過交叉提呈的方式, 通過MHC?Ⅰ類途徑進行提呈, 從而活化CD8+ T細胞, 實現CD8+細胞介導的保護性免疫反應, 這對於清除細胞內的病原體如病毒等至關重要。VLPs進入DCs細胞后能誘導其成熟, 使其細胞表面分子如CD40、 CD80、 CD86 及MHC?Ⅰ和Ⅱ類分子表達水平明顯上調, 同時促進DCs 分泌IL?6、 IL?10、 MIP?1α及TNF?α等細胞因子[9]。VLPs對於DCs的靶向特性對於VLP疫苗來說非常有利, 因為DCs被認為是連接固有免疫應答和適應性免疫應答的橋樑。一些VLPs與天然病毒相似, 仍然保留受體結合區, 從而可以通過受體進入細胞。研究表明, 副黏病毒受體介導的內吞是通過唾液酸與血凝素或神經氨酶相互作用[10], HIV是由CD4分子與HIV?1相互作用介導的, 而HCV與細胞的結合是包膜特異的, 但其中涉及的受體尚不清楚[11]。

3 VLPs與疫苗

VLPs保留了天然病毒顆粒的空間構象和誘導中和抗體的抗原表位, 免疫性強, 不但能激發體液免疫, 而且可以激發細胞和粘膜免疫, 具有安全、高效的特點, 是很有發展前景的候選疫苗或載體。VLPs作為疫苗可分為以下幾類: VLPs疫苗、嵌合VLPs疫苗、 VLPs耦聯或交聯疫苗以及VLPs衝擊DCs后獲得的DCs疫苗。

3.1 VLPs疫苗 多種病毒的殼蛋白或包膜成分都能形成VLPs, 這為我們研究病毒的包裝和開發疫苗奠定了基礎。HBV和HPV的VLPs已經被成功的製成疫苗並已投放市場, 但是有些病原體如HIV?1和HCV等能夠直接影響免疫細胞從而逃避機體免疫系統的監視, 因此這些對疫苗的研究將是個挑戰。但是, 仍有許多研究者致力於這方面的工作, 因為以往的研究證實其他類型的疫苗對HIV感染者不能產生足夠的保護。Hammonds等[12]的研究表明, HIV的VLPs能誘導體液和細胞免疫應答因而是一種很有潛力的疫苗, 他們改進了獲得, 純化等方法, 這對將來把HIV的VLPs用於臨床前試驗和應用於臨床奠定了基礎。研究證實, 許多個體多年面對病毒的慢性感染過程中沒有產生足夠的保護性免疫應答, 這暗示了儘管VLPs與天然病毒結構十分相似, 但是也許並不能夠為機體提供有效的保護作用。因此在一些VLPs疫苗的設計上應該做一些適當的改變, 比如顆粒的大小, 包膜的結構等, 使其能夠靶向DCs或是黏膜表面, 或是通過改變免疫途徑使得疫苗產生最佳的免疫效果。

3.2 嵌合VLPs疫苗 嵌合型VLPs為異源性抗原與VLPs的結合提供了一條途徑, 這其中包括一些不能自動包裝成特定的形式的CTL表位和一些包膜蛋白的片段, 還包括那些沒有良好免疫原性的病毒抗原如來自HIV和HCV的抗原。此外, 嵌合型VLPs也為發展同源VLPs提供了平台, 例如將E6/E7蛋白與HPV的L1蛋白融合[13]。相似的, 嵌合的VLPs也可以展示一些與其毫無關聯的病毒或病原表位（例如將瘧疾表位或是流感病毒的M2蛋白）連接到HBc上[14, 15]。對於這種嵌合型VLPs來說, 最大的局限性就是顆粒所能容納的外源性表位較小, 不能夠插入提呈一些大的抗原表位。Chen等[16]將在B、 T細胞水平具有免疫原性的HBV表面蛋白preS1的5?33個氨基酸連接到截短的HBc羧基末端形成嵌合蛋白HBVCS1。這種顆粒樣蛋白在BALB/c小鼠體內能夠誘導強烈抗HBc及中等強度的抗preS1的免疫應答和特異的T細胞應答。這種疫苗也能降低HBV?Tg小鼠血清中的HBsAg和HBV DNA的滴度。Nardin等[14]進行了一種候選瘧疾疫苗的一期臨床試驗來檢測疫苗的安全性和免疫原性, 這種疫苗就是帶有表達瘧原蟲孢子表位的HBc核心顆粒, 臨床前研究表明由大腸桿菌表達的這種病毒樣顆粒在小鼠和猴體內具有很強的免疫原性。共有20名健康成人志願者參與了一期臨床試驗, 接種劑量為50 μg的絕大多數志願者體內都產生了針對瘧疾抗原的抗體, 而且免疫1次之後就可檢測到分泌IFN?γ的抗原表位特異的T?淋巴細胞。試驗結果表明這是一種很有前途的瘧疾候選疫苗並且證實HBc病毒樣顆粒可以作為外源性抗原表位載體。

3.3 VLPs耦聯或交聯疫苗 將外源免疫原耦聯到VLPs上同樣可以使外源抗原以重複的方式最佳地展示在載體表面。VLPs耦聯疫苗製備的方法是在VLPs免疫反應區中添加一個或多個賴氨酸, 在外源抗原上引入一個半胱氨酸, 這樣可以通過一個雙功能的交聯劑將外源抗原共價地連接到VLPs載體上。

3.4 VLPs衝擊的DCs疫苗 DCs是人體內功能最強的專職抗原提呈細胞, 也是惟一能夠激活初始T淋巴細胞和靜息T淋巴細胞的抗原提呈細胞, 從而激活抗原特異性的T細胞免疫反應。為了了解VLPs如何激活免疫系統, Lenz等[17]研究了乳頭狀瘤病毒樣顆粒與人骨髓來源的抗原提呈細胞的相互作用。結果表明, VLPs能夠黏附到單核細胞、巨噬細胞和DCs的表面並誘導這些細胞成熟和分泌細胞因子。他們的實驗也再次驗證了VLPs能夠靶向免疫系統的多種細胞, 解釋了為何VLPs能夠在沒有佐劑的條件下誘導有效的體液和細胞免疫應答。

近年來DCs用於抗腫瘤免疫治療日益受到重視, 現在通過在體外擴增DCs的同時採用腫瘤或病毒抗原衝擊致敏DCs, 提高DCs的抗原提呈能力, 誘導抗原特異性免疫反應來清除腫瘤細胞。目前通過這種方法製成DCs疫苗的報道已經很多, 也取得了一定的成功。但也存在一些缺憾, 例如在誘導長效抗原特異性免疫應答方面還不盡人意。其最主要的問題可能是, 抗原負載方式存在缺陷, 而導致DC細胞的抗原遞呈效率較差, 或使DCs的壽命縮短, 進而使誘導長效的T細胞應答受到限制。最近本實驗室[18]用HBc?VLPs負載的DCs疫苗免疫小鼠, 有效地激發小鼠的抗原特異性免疫應答, 而且明顯抑制腫瘤在小鼠體內生長, 說明用VLPs衝擊也不失為一種有效的DCs疫苗的製備方式。另外一個問題在設計疫苗時需要考慮的是, 如果是治療性疫苗, 則要求包含特異性的T細胞表位來達到特異性的殺傷目的。這種治療性VLPs疫苗若包裹了CpG作為佐劑可以提高療效, 因為CpG可以通過Toll?9受體來激活DCs。一種插入了淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎的CTL表位的HBc?VLPs疫苗如果包裹了CpG之後會誘導產生更多的肽特異的CD8+T細胞[19]。本室Song等[18]結果也證實HBc?VLPs包裹CpG后獲得長效的抗原特異性免疫應答和抗腫瘤作用。用HBc?VLPs負載的DCs免疫小鼠, 可誘導其產生抗原特異性T細胞應答; 包裹CpG的HBc?VLPs負載DCs后免疫小鼠, 分泌IFN?γ的CD8+T細胞數增多和CTL活性增強, 從而明顯增強了疫苗的免疫效果和抗腫瘤作用。

4 結語

到目前為止, 已經有多種VLPs疫苗在小型動物模型中取得了成功, 而且對於許多難以治療的疾病來說, 它也將會有很大的發展潛力。但是, 人們在開發VLPs疫苗的過程中也遇到了許多困難, 比如病毒樣顆粒在組裝過程中遇到的問題, 以及插入抗原表位的大小和選擇表達系統等。儘管如此, 已經有VLPs疫苗取得了執照, 因此這鼓舞人心的結果將無疑對VLPs疫苗的發展起到很大的促進作用。

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