乳過氧化物酶

LP是過氧化物酶家族的成員之一，是存在於乳汁中的一種血紅素蛋白，是人乳和牛乳中非常常見的成份之一，在哺乳動物的乳腺、唾液腺、淚腺及其分泌物中都能找到。

LP是由一條多膚鏈構成的，包括612個氨基酸殘基，分子量大約是78kD，等電點為9.6，是一種鹼性蛋白，也是一種糖蛋白。它含有一個血紅素和大約10%的碳水化合物，其催化活性中心的血紅素是一個原葉琳ix，通過一個酷鍵共價連接到多膚鏈上構成的。LP中鐵含量是0.07%，鐵是血紅素的一部分，每個LP分子對應一個鐵。研究發現，LP結構中二硫鍵的破壞和亞鐵血紅素的存在與否直接影響LP的活性和穩定性。

在牛乳中，LP是僅次於黃嚓吟氧化酶第二豐富的酶，它在乳中的濃度大約是30mg/L。有報道，LP含量的改變與牛的生殖周期、季節、品種和餵養制度有關，需要注意，不像其它抗菌蛋白，LP的含量在牛初乳中是較低的，但在產後3~5天LP含量迅速增加以達到最大值。不同來源乳中的LP的活性不同，可以看到牛乳中LP的平均活性為2.3U/mL;人乳中LP的活性較低，為0.67一0.97u/mL;豚鼠的LP具有最高的活性，達到22u/mL。據報道，LP的酶活力必須達到0.02U/mL以上才具有抑菌活性。

存在於乳腺、淚腺、唾液腺中的LP在化學上和免疫學上的性質都是類似的。LP參與抑制微生物生長首先被Hanssen提出，他指出LP參與構成宿主對抗入侵微生物的天然防禦系統。除此之外，LP還具有抗菌活性、降解各種致癌物質以及保護動物細胞被過氧化的能力。LP是乳中熱穩定性的酶之一，它的破壞已經被作為巴氏滅菌效力的指標之一。Mark證實了常規的巴氏滅菌不能讓乳中的LP失活，但是，LP在酸性條件下(pH5.3)的熱穩定性會降低，可能是由於鈣從分子中釋放出來，看來鈣離子濃度對LP的熱穩定性有較大影響。LP對許多蛋白質水解酶都是相對穩定的，但是，在核黃素存在下LP對光特別敏感。

所謂LPS必須同時包括3種組成成分，即乳過氧化物酶，硫氰酸鹽和過氧化氫。只有這三種成分共同作用才具有抗菌活性。在實際應用中，若體系中的某一組分濃度不夠時，則需要添加外源或設法生成，以保證抗菌效果，這就是LPS的“激活”。其中，乳過氧化物酶的濃度不低於0.02U/mL。牛乳中天然的LP的濃度為1.4U/mLL，水牛乳中為0.9U/mL可滿足這一要求。因此，無須添加外源，而硫氰酸鹽廣泛存在於動物的組織和分泌液中，乳中的硫氰酸鹽來自血液，濃度僅為3-5μg/mL，成為限制因素。據報道，激活LPS所需的硫氰酸鹽的濃度約為15μg/mL或以上，所以要激發LPS需要添加外源。在剛擠出的牛乳中過氧化氫含量僅為1-2μg/mL，而激活需8-10μg/mL的過氧化氫，必須外源供給過氧化氫。

LPS的抗菌性是表現在對乳中一些微生物具有抑菌或殺菌作用其抗菌機理是微生物細胞質膜上的琉基基團被氧化，導致細胞質膜結構破壞，鉀離子、氨基酸和多膚泄露，使細胞對葡萄糖、氨基酸、漂吟、嚓陡的攝取以及蛋白質、DNA和RNA的合成受到了抑制口l。抗菌因素與供電體、介質、溫度、PH值的不同以及從氧化物的脫氧到糖酵解途徑的堵塞或干涉細胞病變等有關。

不同的細菌對LPS的敏感程度不同。革蘭氏陰性，過氧化物酶陽性細菌，如假單胞菌屬，大腸桿菌，沙門氏菌屬不僅能被抑制，在PH、溫度、培養時間和接種量不同時，還能被殺死。革蘭氏陰性菌如鏈球菌屬和乳酸菌往往只能被抑制。細菌受LPS影響程度的不同可能與細菌的細胞膜結構和特性不同有關。革蘭氏陰性菌的細胞膜比革蘭氏陽性菌的細胞膜更容易被LPS破壞。致使一些營養成份泄漏，妨礙了細菌自身對營養的攝取，最終導致細菌的死亡或衰退。

從山羊乳中純化出的LPO在硫氰酸鹽和過氧化氫的媒介中表現出強的抗真菌能力。山羊乳中的LPS可以抑制黃麴黴、木霉屬的生長繁殖。山羊乳中的LPS還能抑制麴黴屬、交鏈包霉屬、產黃青黴和麥角屬。

鑒於其重要的應用價值，因此測定LP活性尤為重要。目前，國內外有關LP檢測方法的研究較多，大多是基於顏色反應，利用酶促反應原理，藉助分光光度計測定酶活大小。

苯胺類檢測LP活性

以苯胺類為底物測定過氧化物酶活性，其原理為在過氧化物酶存在時，H2O2可使苯胺發生氧化聚合反應，產物為棕褐色物質。該物質於415nm波長下有最大光吸收，因此利用分光光度法測定反應液的吸光度，以吸光度的變化速率來表徵過氧化物酶活力。

愈創木酚法檢測

愈創木酚檢測方法的原理，在LP催化作用下，過氧化氫氧化愈創木酚，產物為醌類化合物，此化合物可進一步縮合或與其他分子縮合，生成紅棕色的4-鄰甲氧基苯酚。利用愈創木酚檢測方法測定LP時要求嚴格控制時間，檢測過程中用酸終止酶促反應，導致試驗結果明顯偏低。

ABTS法檢測

ABTS主要用來測量和表徵抗氧化劑抗氧化能力，是近些年興起的一種相對簡便的用於體外測定物質總抗氧化能力的方法。最初由Marklund提出，用含有蛋白質的血紅素過氧化物酶與ABTS反應生成ABTS+，用於測定樣品中血紅蛋白的含量，目前已廣泛應用於包括血清類的生物樣品、果蔬類和一些純物質抗氧化能力的測定。利用ABTS法檢測LP的原理如下：在LP的催化作用下，過氧化氫可將無色的還原型ABTS氧化，生成的氧化型ABTS為綠色物質，該綠色物質於416nm波長附近有最大光吸收。根據顏色的深淺，藉助於可見分光光度計，測定反應的吸光度，進而換算待測樣的酶活或酶濃度。

TMB法檢測

TMB因其安全性和較高的敏感性，正逐步取代有致癌性的ABTS顯色劑用於LP的檢測中。TMB檢測法的原理是在過氧化物酶存在條件下，TMB能被過氧化氫氧化生成明亮的藍色物質，已知該有色物質于波長655nm下有最大吸收峰。根據顏色的深淺，藉助分光光度計，測定反應的吸光度，進而換算待測樣的酶活或酶濃度。

免疫學方法

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）即將抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行的技術。ELISA方法是近30年來發展起來的綜合性酶免疫化學分析方法，採用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，然後通過酶與底物產生顏色反應，用於定量測定抗原或者抗體。使用該測定方法有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）、酶標記的抗原或抗體（標記物）、酶作用的底物（顯色劑）。