發酵液

食用菌是蛋白質和氨基酸的良好來源, 食用菌中的蛋白質含量高, 蛋白質消化率高, 在人體消化酶的作用下分解成氨基酸而被人體吸收, 具有較高的營養保健價值, 可促進嬰幼兒健康成長和智力發展。常用的蛋白質提取方法主要有水溶液輔助超聲波、微波提取法, 有機溶劑提取法, 酶解法, 反膠團萃取法, 雙水相萃取法。食用菌蛋白質具有藥物活性, 抗腫瘤、調節免疫、抗氧化是主要生理功能, 食用菌發酵液中蛋白質成分更具有直接抗腫瘤的作用。隨著蛋白質分子量的增加, 將主要起營養作用, 功能作用逐漸衰弱, 發酵液中的氨基酸、多肽研究日益廣泛, 發酵液中的大分子蛋白質主要以酶的形式發揮作用。蛋白質純化技術常採用透析、超濾、離心、分子篩、瓊脂糖凝膠、Ni-NTA樹脂、DEAE純化技術等。透析和超濾技術可以實現蛋白質與金屬離子的分離, 分子篩和樹脂純化可以得到不同分子量大小的凝膠, 但是這些純化過程得到的蛋白質會伴隨產生很多雜質, 為了進一步純化還需要進行DEAE純化。得到的蛋白質溶液進行電泳分析, 如果所含蛋白質種類不多, 可以直接進行硫酸銨鹽沉澱, 此時蛋白質純度也比較高。

食用菌多糖中發揮活性成分是具有分支的β- (1, 3) -D-葡聚糖, 食用菌中生物活性最顯著、含量最高的是多糖, 因此對食用菌發酵液多糖的開發利用研究的最徹底。多糖極難溶於有機溶劑, 一般採用熱水浸提、稀鹼浸提、強酸浸提的方法提取, 對於多糖而言, 超聲波輔助提取多糖得率高於微波提取。強酸性條件下, 多糖含有醛酸等酸性基團極難溶於酸性條件, 因此使得酸提多糖呈鹼性, 鹼提條件則正好相反。將浸提液進行離心、濃縮後用乙醇沉澱得到粗多糖, 分子量大的多糖聚集在乙醇液面上, 分子量小的則聚集在底部, 食用菌發酵液多糖的提取過程中, 多糖粘性大極易吸附蛋白質和色素, 影響多糖純度和生物活性效果, 需要經過真空濃縮、Sevag法去除蛋白質、H2O2脫色、透析等處理后可以得到粗多糖, 經離子交換柱和凝膠柱純化即可得到純多糖。多糖純度越高越穩定, 越不易變質。真空濃縮體積到1/4, 濃縮濃度越大, 多糖越容易醇沉, 但是濃縮過程中容易導致多糖降解造成損失, 時間不宜太長。食用菌多糖隨提取溫度增加得率增加, 溫度超過90℃后多糖降解加快, 提取溫度一般不宜超過90℃。脫蛋白、色素、透析純化多糖過程中會導致多糖的降解與結構改變, 而且分子量也會受到影響,單糖之間的連接鍵受到破壞, 多糖整體的氧化還原能力會發生變化。柱層析純化多糖通過多糖的極性及多糖的分子量大小進行分離, 得到的多糖較符合天然多糖的結構, 條件比較溫和, 而且多糖損失量少, 但對上柱的多糖純度要求高, 雜質較多會導致層析介質的堵塞, 影響純化效果。一般柱層析之前需要進行脫蛋白、色素、透析處理。

萜類化合物是異戊二烯、異戊烷以各種方式連接形成的天然化合物, 精油中含量豐富, 在食用菌中, 三萜類化合物及倍半萜類化合物較多, 含有27~30個碳原子, 6個異戊二烯單位, 其前提是鯊烯。三萜類代表性物質是具有抗瘧疾作用的青蒿素。三萜類化合物主要採用有機溶劑提取法, 利用超聲波、微波輔助提取, 超聲提取法、超臨界流體萃取法和製備衍生物法。主要採用氯仿、甲醇、乙醇等有機溶劑提取, 水溶性極差。超聲波、微波提取工藝有利於提高三萜物質提取率, 且提取物質穩定性比較高。萜類物質對熱敏感, 提取溫度不宜過高。萜類物質主要測定方法有重量法、比色法、薄層色譜 (TLC) 法、高效液相色譜 (HPLC) 法、氣相 (GC) 法。三萜類物質的純化採用大孔吸附樹脂法及硅膠柱層析法,大孔吸附樹脂得到的帖類物質比較粗糙, 含有色素等雜質, 之後需要進行採用硅膠柱層析進一步純化, 洗脫劑常用氯仿-甲醇-水體系。

核酸是由許多含氮的鹼基、磷酸、核糖或脫氧核糖三種分子構成核苷酸, 核苷酸間通過3', 5'-磷酸二酯鍵聚合而成的生物大分子物質, 屬於生命物質。核苷酸可採用微波、超聲波、研磨珠、凍融法對核苷酸進行提取。核酸水解產物常採用離子交換樹脂、反相液相色譜法、毛細管電泳、薄層電泳、離子對色譜法分離, 核酸與蛋白質分別在260 nm和280 nm處有最大吸收峰, 因此, 核苷酸的純度可用A260/A280的比值來判斷。離子交換樹脂可以根據核苷酸的等電點不同進行分離, 不同的核苷酸種類需要不同的洗脫劑, CMP需要用甲酸洗脫,GMP需要Na CL洗脫, UMP則需要甲酸與甲酸鈉混合液洗脫。液相色譜法及電泳技術常用於實驗室核苷酸種類的鑒定, 不適合大規模分離純化, 不利於核苷酸的積累。

核苷酸類物質對細胞增殖、蛋白質合成具有調控作用, 可以作為誘導因子抑制癌細胞的增殖, 其中5'-核苷酸是常用抗病毒抗腫瘤藥物原料。此外, 食用菌中的核苷酸類物質起到增鮮的作用, 是提取食品調味料的重要原料。庄瑋婧等對食用菌發酵液中的核苷酸進行了測定得出靈芝發酵液的核苷酸質量濃度最高, 並且靈芝在發酵的第三階段各成分含量達到最高。Tang J P等從冬蟲夏草中提取核苷類物質蟲草素, 並採用高效液相和紫外分析儀測得純度高達90.54%, 進行細胞增殖抑制試驗發現蟲草素對SH-SY5Y細胞沒有抑制作用, 在濃度133μmol/L條件下對RM-1細胞達到半數清除率。核苷酸的功能性研究較少, 更多的是作為一種鮮味劑進行研究。

通過增加發酵液中Fe2+, 茉莉酸甲酯含量可以增加食用菌次級代謝核苷酸類物質的產生, 可以作為信號分子調節核苷類物質的代謝從而促進核苷類物質的產生與釋放。核苷酸類作為胞內成分, 發酵液中含量比較少, 可以通過核苷酸的含量研究食用菌生長過程中的細胞代謝活動。

多酚是有兒茶素和表兒茶素通過C-C鍵組成的大分子化合物, 食用菌中的多酚類物質來自於次級代謝產物。酚類檢測常用Folin酚法、高錳酸鉀法、酒石酸亞鐵法,紫外分光光度法等, Folin酚法由於操作最簡捷, 用時最短應用最廣。採用溶劑萃取法、超聲波輔助提取、超臨界流體、微波輔助提取法、亞臨界水提取法、生物酶提取法及膜技術提取法等進行提取。丙酮對多酚的提取最好, 且沸點低, 對正常細胞毒害較小, 應用廣。多酚的純化比較簡單, 採用大孔樹脂即可獲得純度在65%的多酚, 樹脂純化弊端在於得到的多酚物質常含有大量的黃酮類物質, 洗脫液需要進行降酮處理,鋁鹽沉澱黃酮類物質, 多酚純度越高, 顏色越淺。

由於發酵液中包含食用菌的各類代謝物, 發酵液中的活性物質種類複雜多樣, 就同一物質而言, 由於其培育菌絲體不同, 所得發酵液不同, 發酵液的功能活性與菌絲體是密切聯繫的。有些食用菌中含有三元配合物, 例如氯黴素, 不僅廣泛存在於菌絲體中, 數十種真菌深層發酵液中含量頗豐, 最高達38.6μg/L, 具有明顯的抑菌效果。液體發酵液活性成分除了用於醫療保健行業, 化工行業也將研究目光投向液體深層發酵液。張代佳等採用超濾醇沉法提取1, 3-丙二醇, 用於生產化纖產品聚對苯二甲酸丙二酯 (PTT) , 由於食用菌發酵液成分複雜1, 3-丙二醇很多情況下難以進行純化分離。

食用菌發酵液成分除了未被利用的營養成分纖維素、半纖維素等, 還包括一些食用菌的初級、次級代謝產物, 這些物質具有功能活性, 對人類具有重要的研究價值。食用菌發酵液的功能活性與萃取溶劑密切相關, 方熹君研究發現正己烷萃取虎奶菇發酵液沒有生物活性, 丁醇萃取物具有明顯的抑菌活性, 得出脂溶性小分子抑菌效果好的結論。席亞麗等研究荷葉離褶傘發酵液中的營養成分發現其維生素含量最為豐富, 主要是B族維生素和Vc, Vc含量高達27.8 mg/100g, 此外, 小分子氨基酸含量豐富, 不含有重金屬, 可利用價值高。林陳強等研究發現虎奶菇液體發酵液中可以提取抗生素:2-呋喃甲酸, 酸性物質, 具有良好的抑菌作用, 不耐高溫、強鹼。

菌體細胞和蛋白質等雜質的存在, 會使發酵液黏度升高, 影響後續的分離操作, 特別是在精餾過程中, 隨著水分減少, 發酵液逐步呈粘稠狀, 使PDO的分離變得更加困難, 甚至結焦污染換熱器, 因此第一步需要對發酵液預處理, 除去上述雜質。

1 離心

離心是一種常見的固液分離方法, 可以很好的除去菌體和蛋白質等大分子物質, 但由於需要較高的轉速, 而且樣品處理量較小, 導致設備投資和能耗很高, 不適合工業化生產。

2 膜過濾

該法是利用具有一定選擇透過性的過濾介質對目標物質進行分離, 常見的有微濾、超濾、納濾, 可根據各物質分子量的不同進行分離。發酵液的預處理一般可以利用超濾膜過濾除去發酵液中的大分子物質。

3 絮凝

絮凝就是通過添加絮凝劑, 使液體中不易沉降的懸浮顆粒聚集成團, 從而易於沉降。

4 雙水相萃取

當親水性有機溶劑 (小分子醇和酮) 與水和無機鹽以適當的比例混合時, 會出現液液分層的現象, 該雙水相體系被稱為新型雙水相體系。在此新型雙水相體系中, 發酵液中的PDO及其他醇類物質 (比如殘餘甘油) 主要進入有機相 (萃取相) , 而發酵液中的其他成分主要進入水相 (萃余相) , 可去除發酵液中的絕大部分菌體、蛋白質、鹽以及其他雜質。