原位PCR

處理后的標本，既要保持組織，細胞的形態結構，並增加細胞膜通透性，又要充分暴露擬擴增的目的DNA或RNA，使引物、探針能有效進入胞漿中發生反應。

主要應用於兩方面：（1）檢測外源性基因片段，提高檢出率，集中在病毒感染的檢查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）觀察病原體在體內分佈規律（3）內源性基因片段，如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。（4）檢測導入基因；（5）遺傳病基因檢測如β－地中海貧血。

實驗用的標本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細胞、血細胞等。其基本方法為多聚甲醛固定組織或細胞，蛋白酶消化處理組織；在組織細胞片上滴加PCR反應液進行擴增，覆蓋並加液體石蠟后，在原位PCR儀上進行PCR循環擴增，PCR擴增結束後用標記的探針進行原位雜交，最後顯微鏡觀察結果。

清潔液清洗→自來水沖，烘乾→強酸24h→自來水，蒸餾水洗，烘乾95%乙醇數小時→烘乾，高壓消毒。再用多聚賴氨酸APES(3-氨丙基三乙氧硅烷)包被。

固定液的選擇標準是什麼？

保持組織結構，最大限度地保持細胞內DNA或RNA水平，使引物和探針更易於進入細胞內，在規定的時間內進行反應。

固 定 劑 固 定 時 間

細 胞 組 織

甲醇/丙酮(1:2) 4min 20min

甲醇/丙酮(1:1) 4min 20min

4%多聚甲醛 30min 60min

2%戊二醛 30min 60min

10%中性福爾馬林 overnight overnight

① 固定組織或細胞：將組織細胞固定於預先用四氟乙烯包被的玻片上，並用多聚甲醛處理，再滅活除去細胞內源性過氧化物酶。

②蛋白酶K消化處理：用60ug/ml的蛋白酶K將固定好的組織細胞片55℃消化處理2h后，96℃2min以滅活蛋白酶K。

③PCR擴增：在組織細胞片上，加PCR反應液，覆蓋並加液體石蠟后，直接放在擴增儀的金屬板上，進行PCR循環擴增。有的基因擴增儀帶有專門用於原位PCR的裝置。

④雜交：PCR擴增結束后，用標記的寡核苷酸探針進行原位雜交。

⑤顯微鏡觀察結果。

待檢石蠟切片上的非特異性結合位點經過充分封閉，內源性DNA和RNA經核酶充分消化后，通過生物素化單抗與親和素系統的橋聯，將生物素化的DNA報告分子固定在石蠟切片上，進行原位PCR擴增，擴增產物經原位核酸雜交，以雜交信號指示待測抗原是否存在。

PCR是提取細胞或組織中的DNA進行基因擴增反應，而原位PCR是保持細胞或組織的完整性，使PCR反應體系滲透到組織和細胞中，在細胞的靶DNA所在的位置上進行基因擴增，不但可以檢測到靶DNA，而且還可以了解靶DNA存在於何種細胞中，更有利於探討靶DNA與細胞之間的關係。

PCR所採用的反應體系能否應用於原位PCR

PCR與原位PCR所採用的反應體系中都包括Taq聚合酶緩衝液、Mg2+、K+、4×dNTP、一對特異性引物和Taq聚合酶。但是由於組織細胞間質會吸附Mg2+，所以原位PCR中採用的Mg2+濃度要比PCR的要高，採用4.5-5.5mM可以保證有足夠的Mg2+進行反應。另外由於原位PCR中的基因擴增過程中，各反應成分須經過滲透到靶DNA處才能進行擴增，所以建議將反應循環數增加到35 個。

原位PCR反應是在載玻片的平面上進行，保持水平可以使反應各組分均勻地分佈在組織切片上，所以須在原位PCR儀上進行，該儀器不但可以使載玻片保持水平，而且還可以給載玻片進行均勻地加熱，保證擴增反應的順利進行。

與原位雜交一樣，檢測原位PCR結果的探針可以是DNA探針，也可以是寡核苷酸探針，DNA探針的長度在100－200bp為宜，寡核苷酸探針為多個，在20－40bp為宜。

常用標記物有地高辛半抗原（digaoxigenin），生物素（biotin），過氧化物酶（HRP），還可以標記一些熒光物質如異硫氰酸熒光素（FITC），花青（cyanine，Cy2，Cy3，Cy5）等。

設立陽性對照，即用已知陽性細胞或組織切片做陽性標誌，實驗結果應呈陽性，表明實驗方法準確可靠。同時要設立陰性對照，即用已知陰性細胞或組織切片作陰性對照，實驗結果應呈陰性，表示實驗方法無假陽性結果；也可以用實驗細胞或組織切片，不加標記的dUTP（直接法），PCR結果顯示陰性，或不加引物或不加TaqDNA聚合酶等，結果均應陰性。

原位PCR中直接法和間接法有何異同

直接法：進行原位PCR擴增以前，把同位素或非同位素(常用)標記的核苷(如dig-dUTP及Biotin-dUTP)標記的底物或引物5’末端連接標記物加入PCR反應液中，隨著擴增的進行，標記的核苷或引物直接摻入到PCR產物中，然後免疫組化直接進行檢測。間接法：先進行細胞內目的DNA基因原位擴增，然後用標記的探針進行核酸分子原位雜交以定位檢測擴增的DNA的技術，步驟相對較多，需時長，但結果可靠。

獲得特異原位PCR結果需要考慮哪些關鍵因素

原位PCR技術操作包括了組織學技術、PCR技術、原位雜交技術及免疫組化學技術，因此在複雜的操作過程中，有很多因素影響實驗結果。要考慮的一些關鍵因素有待檢組織的有效固定，在PCR前的組織預處理包括酶消化使核酸有效暴露，PCR環節中要設計特異的擴增引物、Mg2+的濃度、TaqDNA聚合酶用量、反應循環參數。間接法中用原位雜交檢測時考慮探針濃度、抗體濃度和顯色時間。

原位PCR中的組織預處理和原位雜交是否相同

要獲得理想的原位PCR結果，需要將待檢組織進行預處理使核酸充分暴露，這和原位雜交組織預處理的原則相同。因此原位雜交中的組織預處理步驟如HCL和蛋白酶處理等同樣適用於原位PCR。

PCR雖然能擴增包括福爾馬林固定、石蠟包埋組織的各種標本的DNA，但擴增的DNA或RNA產物不能在組織細胞中定位，因而不能直接與特定的組織細胞特徵相聯繫，這是該技術一個局限性。原位雜交雖具有良好的定位能力，但由於其敏感性問題，尤其是在石蠟切片中，尚不能檢測出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR可使擴增的特定DNA片段在分離細胞和組織切片中定位，從而彌補了PCR和原位雜交的不足。

組織晶元和傳統的病理切片進行原位PCR異同

兩者實驗所需試劑沒有差別，但由於組織晶元的高通量特點，比起傳統的病理切片來說，所加的試劑量要遠遠低於病理切片，勞動強度也大大降低。

主機一台，個人存儲卡一張，原位PCR適配器

1.適用於96×0.2ml PCR管或77×0.5ml PCR管或8×12PCR板不需要更換模塊；

2.反應槽溫控範圍：4-99℃；

3.控溫精度：±0.2℃；

4.模塊均一性：≤±0.5℃；

5.溫控速率：升3℃/秒，降2℃/秒，速率可調；

6.程序數目：儀器可存100個，配單獨的個人卡，卡上可存10個，方便插入其他同類機器上直接調用預設好的程序；

7.設有斷電自動重啟選項

8. RS-232介面和印表機介面

9. 編程模式：梯度功能、可調升降溫速率、時間和溫度增幅、孵育模式、原位模式、鏈接功能、暫停功能；

10. 帶熱蓋，熱蓋溫度和高度可調，控溫範圍：37-110℃；

11.尺寸(長x 寬x 高) cm：26 x 41 x 27

12.重量(kg)：12.4

13.最大功率要求: 500 W

14.電源：所有型號均為230 V/50-60 Hz