動物細胞工程

動物細胞培養：從動物機體中取出相關的組織，將它們分散成單個細胞，然後放在適宜的培養基中，生長，增殖。

1丶或組織。

2，

常用方法，物理：剪刀剪碎，

化學法：胰蛋白酶，膠原蛋白酶

3丶製作細胞懸浮液，方法：加培養液。形成細胞懸浮液

4丶培養細胞株，原代培養，傳代培養

5丶形成細胞系，傳代培養，遺傳物質的改變。

方法：

物理法，電刺激，振動，離心。

化學法，聚乙二醇（PEG）強烈的吸水性，有凝聚蛋白質的作用。

病毒法，紫外線照射后滅活仙台病毒，喪失了感染活性，保留了融合活性

原理：細胞膜的流動性。

用途及意義：製備單克隆抗體。

單克隆：由一個細胞通過有絲分裂形成一個細胞群。

單克隆抗體：由一個漿細胞通過有絲分裂形成一個細胞群，這個細胞群可以產生特異性抗體。

利用了免疫，細胞融合，動物細胞培養等原理。

B淋巴細胞在抗原的刺激下，能夠分化、增殖形成具有針對這種抗原分泌特異性抗體的能力。B細胞的這種能力和量是有限的，不可能持續分化增殖下去，因此產生免疫球蛋白的能力也是極其微小的。將這種B細胞與非分泌型的骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞，再進一步克隆化，這種克隆化的雜交瘤細胞是既具有瘤的無限生長的能力，又具有產生特異性抗體的B淋巴細胞的能力，將這種克隆化的雜交瘤細胞進行培養或注入小鼠體內即可獲得大量的高效價、單一的特異性抗體。這種技術即稱為單克隆抗體技術。

效應B細胞（只有效應B淋巴細胞才能產生出特異性的抗體）

骨髓瘤細胞（能無限增殖）

1）免疫脾細胞的製備 製備單克隆抗體的動物多採用純系Balb/c小鼠。免疫的方法取決於所用抗原的性質。免疫方法同一般血清的製備，也可採用脾內直接免疫法。

2）骨髓瘤細胞的培養與篩選 在融合前，骨髓瘤細胞應經過含8-AG的培養基篩選，防止細胞發生突變恢復HGPRT的活性（恢復HGPRT的活性的細胞不能在含8-AG的培養基中存活）。骨髓瘤細胞用10%小牛血清的培養液在細胞培養瓶中培養，融合前24h換液一次，使骨髓瘤細胞處於對數生長期。

3）細胞融合的關鍵:

1技術上的誤差常常導致融合的失敗。例如，供者淋巴細胞沒有查到免疫應答。這必然要失敗的。

2融合試驗最大的失敗原因是污染，融合成功的關鍵是提供一個乾淨的環境，以及適宜的無菌操作技術。

4）陽性克隆的篩選 應儘早進行。通常在融合后10天作第一次檢測，過早容易出現假陽性。檢測方法應靈敏、準確、而且簡便快速。具體應用的方法應根據抗原的性質，以及所需單克隆抗體的功能進行選擇。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫熒光法等。其中ELISA法最簡便，RIA法最準確。陽性克隆的篩選應進行多次，均陽性時才確定為陽性克隆進行擴增。

5）克隆化 克隆化的目的是為了獲得單一細胞系的群體。克隆化應儘早進行並反覆篩選。這是因為初期的雜交瘤細胞是不穩定的，有丟失染色體的傾向。反覆克隆化后可獲得穩定的雜交瘤細胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀釋法。

（1）顯微操作法：在顯微鏡下取單細胞，然後進行單細胞培養。這種方法操作複雜，效率低，故不常用。

（2）有限稀釋法：將對數生長期的雜交瘤細胞用培養液作一定的稀釋后，按每孔1個細胞接種在培養皿中，細胞增值后成為單克隆細胞系。第一次克隆化時加一定量的飼養細胞。由於第一次克隆化生長的細胞不能保證單克隆化，所以為獲得穩定的單克隆細胞株需經2～3次的再克隆才成。應該注意的是，每次克隆化過程中所有有意義的細胞都應冷凍保存，以便重複檢查，避免丟失有意義的細胞。

（3）軟瓊脂法：將雜交瘤細胞稀釋到一定密度，然後與瓊脂混懸。在瓊脂中的細胞不能自由移動，彼此互不相混，從而達到單細胞培養的目的。但此法不如有限稀釋法好。

（4）熒光激光細胞分類法：用抗原包被的熒光乳膠微球標記雜交瘤細胞，然後根據抗原與雜交瘤細胞結合的特異性選出細胞，並進行單細胞培養。

6）細胞的凍存與復甦

7）大規模單克隆抗體的製備 選出的陽性細胞株應及早進行抗體製備，因為融合細胞隨培養時間延長，發生污染、染包體丟失和細胞死亡的機率增加。抗體製備有兩種方法。一是增量培養法，即將雜交瘤細胞在體外培養，在培養液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設備，一般應用無血清培養基，以利於單克隆抗體的濃縮和純化。最普遍採用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產生，每隻小鼠可收集5～10ml的腹水，有時甚至超過40ml。該法製備的腹水抗體含量高，每毫升可達數毫克甚至數十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便於抗體的純化。

1.作為診斷試劑：單克隆抗體在疾病的診斷，治療及預防方面與常規抗體相比具有特異性強，靈敏度高的特點，優越性非常明顯。

2.用於治療疾病和運載藥物：為治療癌症，可在單克隆抗體上連接抗癌藥物，製成”生物導彈”將藥物定向帶到癌細胞所在部位，既消滅了癌細胞又不會傷害健康細胞。

用於以下各種生命科學實驗並具有醫用價值

（1）沉澱反應：Precipitation reaction

（2）凝集實驗：haemaglutination

（3）放射免疫學方法檢測免疫複合物

（4）流式細胞儀：用於細胞的分型和細胞分離。

（5）ELISA 等免疫學檢測

（6）BIAcore biosensor:檢測Ab-Ag或與蛋白的親和力。

(7) 免疫印記（western blotting)

（8）免疫沉澱：

（9）親和層析：分離蛋白質

（10）磁珠分離細胞

（11）臨床疾病的診斷和治療；

試管動物：是用人工方法讓卵細胞和精子在體外受精，並進行早期胚胎培養，然後移植到母體子宮內發育而誕生的動物。

胚胎移植：將雌性動物的早期胚胎，或者通過體外受精及其他方式得到的胚胎，移到同種的，生理狀態相同的其他雌性動物體內，使之繼續發育成新個體。

胚胎移植的優勢：可以充分發揮雌性優良個體的繁殖潛力。