水蛭素

水蛭屬於高度特化的環節動物，始載於《神農本草經》，俗稱螞蝗，是我國傳統的中藥，味咸、苦，性平。《中華人民共和國藥典》載具有破血、逐瘀、通經之療效，主要用於治療瘤症、痞塊、血瘀、閉經和跌打損傷。1884年，Haycraft首次在歐洲醫用水蛭的唾液腺里發現了一種生物活性物質水蛭素;1927年,Shionoya最先把它作為抗血栓的有效藥物來進行研究;1955Markwardt指出其為蛋白物質，並命名為水蛭素。天然水蛭素是從醫用水蛭中提取的一種抗凝血蛋白質，是由65個或66個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，相對分子質量為7000Dalton。水蛭素的N末端有3對二硫鍵，使N末端肽鏈繞疊成密集的環肽結構，對蛋白結構起穩定作用。其N末端含活性中心，能識別底物即凝血酶鹼性氨基酸富集位點，並與之結合。C末端富含酸性氨基酸殘基，最後9個氨基酸中有6個為酸性氨基酸。

水蛭素肽鏈中部有一個由Pro-Lys-Pro組成的特殊序列，不被一般蛋白酶降解，這一結構有2個方面的作用:①維持水蛭素分子的穩定性;②引導水蛭素分子以正確的方向與凝血酶分子結合。

一系列酶促級聯放大反應在內源性和外源性凝血過程中使凝血酶原活化，生成凝血酶。凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶，在血栓形成過程中起非常關鍵的作用，包括血凝過程的級聯反應、纖維蛋白沉積和血小板活化等。抗凝抑製劑可分為間接凝血酶抑製劑和直接抗凝血酶抑製劑。前者是通過催化凝血酶的天然抑製劑( AT III或肝素輔助因子II)而產生抗凝作用。而水蛭素是特異性凝血酶抑製劑，能與凝血酶直接結合，其抗凝作用不依賴AT III或肝素輔助因子II ,屬直接凝血酶抑製劑。水蛭素通過作用於凝血酶的非活性底物識別位點和酶活性中心2個位點，與凝血酶1：1結合形成不可逆的複合物，從而使凝血酶失去作用。水蛭素的抗凝作用不但專一，而且其抗凝活性明顯強於肝素。此外，水蛭素不僅能抑制血漿中遊離的凝血酶。

動物試驗與臨床研究表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反應等進一步血瘀現象。此外，它還能抑制凝血酶誘導的成纖維細胞的增殖和凝血酶對內皮細胞的刺激。與肝素相比，它不僅用量少，不會引起出血，也不依賴於內源性輔助因子；而肝素則有引起出血的危險，在瀰漫性血管內凝血的發病過程中抗凝血酶III往往減少，這將限制肝素的療效，採用水蛭會有較好的效果。

水蛭素是一類很有前途的抗凝化瘀藥物，它可用於治療各種血栓疾病，尤其是靜脈血栓和瀰漫性血管凝血的治療；也可用於外科手術后預防動脈血栓的形成，預防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善體外血液循環和血液透析過程。在顯微外科手術中常因為吻合處血管栓塞而導致失敗，採用水蛭素可促進傷口癒合。研究還表明，水蛭素在腫瘤治療中也能發揮作用。它能阻止腫瘤細胞的轉移，已證明有療效的腫瘤如纖維肉瘤，骨肉瘤，血管肉瘤，黑素瘤和白血病等。水蛭素還可配合化學治療和放射治療，由於促進腫瘤中的血流而增強療效。

動物試驗和臨床研究表明，靜脈或皮下注射水蛭素均無明顯毒副作用，無論急性、亞急性的毒性試驗，對血壓、心率、血相、出血時間和血液化學成分均不受影響，呼吸系統也沒有影響，無過敏反應，一般無特異抗體發現。半致死劑量LD50>50mgAg，遠大於治療所用的劑量(1mgAg)。尤其值得指出的是，水蛭素可以口服，這給用藥帶來很大方便。水蛭素比較穩定，胰蛋白酶和糜蛋白酶並不破壞其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用，這就可以解釋為何口服中藥水蛭提取液仍然有療效的原理。

其年產值達數千萬元。含水蛭的新葯也在不斷研究和推出。利用基因工程生產重組水蛭類多肽藥物，以取代水蛭素或作為抗凝化瘀葯的添加成分，則還需要進一步的臨床研究。毋庸置疑，重組水蛭素類多肽藥物的開發將會帶來巨大的社會效益和經濟效益。

天然水蛭素是一種從吸血類水蛭唾液腺及其分泌液中提取的天然活性物質，而重組水蛭素則是通過基因工程獲得的人工產品。重組水蛭素的氨基酸序列和結構與天然水蛭素唯一不同的是其在63位酪氨酸殘基未硫酸化，該特點使其對凝血酶的抑制作用明顯降低，僅為天然水蛭素的1/10。重組水蛭素在藥理活性、葯代動力學方面與天然水蛭素非常相似。

由於多種原因，世界上對天然水蛭素的藥理學和臨床研究嚴重滯后，對重組水蛭素的研究也是在1986年後才陸續開始的，近十幾年來的文獻大多都是研究有關重組水蛭素的內容，故在本章節的藥理學和臨床研究的內容中收錄了重組水蛭素文獻資料，以佐證天然水蛭素的相關作用與應用。

體內外試驗表明，水蛭素是迄今發現的作用最強的凝血酶特異性抑製劑，對各種血栓性疾病都有效。水蛭素的作用機制是它與凝血酶按1:1的比例非共價結合形成一種穩定的複合物，抑制了凝血酶的活性，從而阻止了纖維蛋白原凝固及凝血酶對血小板的作用，達到抗凝的目的，同時水蛭素的作用不依賴於抗凝血酶m，其抑制血栓形成的濃度遠小於其引起出血的濃度，無明顯毒副作用。

水蛭素具有抗凝、抗血栓、抑制血小板聚集、降血脂、改善血液流變學、抗腫瘤等多種藥理作用。

我們對重組水蛭素基因工程作了大量系統的研究，具有堅實的技術基礎。我們從國內養殖的醫用水蛭中克隆出水蛭素的cDNA進行測序，併合成了大腸桿菌偏愛密碼子的水蛭素基因，構建了分泌型大腸桿菌表達載體，優化表達條件，獲得高效表達，產物直接分泌至跑外，大大簡化了下游工程。我們根據水蛭素的特性，設計了適合大規模生產的低成本的分離純化新工藝，無需高效液相層析或反相層析，只經三步純化，即獲得電泳純的產品。

重組水蛭素

由於水蛭素具有重要開發價值，而水蛭的來源有限，故國內外醫藥界均著重研究通過基因工程獲得重組水蛭素。1986年後，重組水蛭素已在大腸桿菌和酶母中分別表達成功，與天然水蛭素相比，重組水蛭素在第63位氨基酸（酪氨酸）上未硫酸酪化，活性略低，其餘性質基本相同。在治療的劑量下靜脈注射無毒副反應。現國外一些大的生物技術公司對水蛭素己進入多方面的臨床研究。有關水蛭素類多肽的專利，每年公布的數量至少在十多項以上，包括水蛭素類似的多肽，研究論文每年總在數十篇以上。1998年底重組水蛭素藥物在德國正式上市，1999年英國批准上市，己註冊的國家有美國、歐洲、澳大利亞、紐西蘭、南非等10多個國家。

水蛭素在使用過程中血清半衰期太短，難以發揮抗栓效果。將水蛭素與PEG（聚乙二醇）一起加工成為耦合體製劑后可大大延長水蛭素的血清半衰期從而提高其在體內的抗血栓生成效果----（聚乙二醇（PEG）修飾是常用的提高蛋白和多肽類藥物血漿半衰期的方法）。

心血管系統疾病和腫瘤是主要危害人類健康的兩大類病害，防治這兩大類疾病的藥物是新葯研製的重點。水蛭在破血、逐瘀、通經、消症等方面的療效已為我國數千年中醫實踐所證明，重組水蛭素在抗凝消栓以及配合腫瘤化療和放療上的作用也為國外臨床所證明。注射針劑的要求較高，將重組水蛭素類多肽藥物取代水蛭或作為中成藥的添加成分，估計至少可獲得上億元的經濟效益。隨著臨床試驗的擴大，它將可以用於更多的疾病的防治，發展前景十分廣闊。

表達水平，純化工藝，產品質量與國外水平相當，某些技術指標超過國外，成本比國外低。

在美國，藥用重組水蛭素每毫克6美元。我國生產的成本低，如果每毫克降至人民幣6元，廣大患者就有可能承受得起。國外重組水蛭素都採用針劑，我們正在研製口服劑型，口服無疑更易被病人接受，成本也可更多降低。尤其是它可以拓寬使用的範圍，用於各種血栓病的防治，或作為有關藥物的主要成分或添加成分，可開發更大的市場。

在醫藥市場上，抗栓藥物的需求與日俱增，但由於天然水蛭來源有限，各國醫藥界都將注意力集中在重組水蛭素的開發上。美國、法國、瑞士、德國、英國、日本十多家生物技術公司和醫院都在臨床應用或研究重組水蛭素類多肽抗栓藥物治療血栓疾病的範圍和療效。1998年底，德國首先上市重組水蛭素藥物。1999年英國也獲批准上市。

中國具有心血管疾病藥物和腫瘤藥物的巨大市場，水蛭素又是傳統中藥，因此重組水蛭素開發前景十分看好。

據估計，每年共需300—500公斤。

國際上常用肝素作為抗凝藥物，這類抗凝藥物的使用已有60多年歷史，需用量逐年增加。美國70年代每年就有1000萬病人使用肝素，大部分是手術后預防血栓的形成。僅美國肝素的年用量就超過9000億單位，約相當於6噸。研究表明，水蛭素在許多性能上都優於肝素，它用藥量小，不引起出血，也不依賴於內源性輔助因子。

隨著臨床研究的廣泛開展，重組水蛭素的應用範圍不斷拓寬，它的需求也會日益增大。

第一，水蛭素與水蛭肽抑制凝血酶的反應不需要抗凝血酶Ⅲ(AT—Ⅲ)作為輔助因子，使其抗凝作用與量效關係更吻合，而且可在缺乏抗凝血酶Ⅲ的病人(如瀰漫性血管內凝血)中使用。

第二，肝素不能滅活結和於血栓上的凝血酶。而水蛭素與水蛭肽則對循環中的和結合於血栓上的凝血酶都可以抑制。

第三，肝素會被激活的血小板釋放的血小板因子4(PTF4)或富含組氨基酸的糖蛋白等結合，水蛭素與水蛭肽則不受這些因素的影響。

第四，水蛭素與水蛭肽用於抗血栓治療，出血副作用較小，且無過敏反應和免疫原性無毒反應。

天然水蛭素是由65或66個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，分子量約為7000，能在極端的pH和熱條件下穩定存在。水蛭素的形狀類似蝌蚪，蝌蚪頭部是多肽的N端，富含半胱氨酸（cys），半胱氨酸間相互作用形成3個二硫鍵（Cys6-Cys14，Cys16-Cys28，Cys22-Cys39）使N末端結構緊密；蝌蚪尾部是含有多個酸性氨基酸和一個被磺酸化的酪氨酸（Tyr63）的多肽C末端。凝血酶（thrombin）是血液凝固和止血過程中的中心酶，它不但能剪切纖維蛋白原，將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白；還能激活其它的凝固血液的酶類，如凝血因子Ⅴ、Ⅷ、ⅩⅢ和抗凝血酶蛋白C（Fenton，1981）等。凝血酶與大分子底物的相互作用取決於三個不同的區域：催化反應位點的初級結合位C（Magnusen，1971），鄰近催化位點的非極性結合位點AB（Brlinr and Shen，1977；Sonder and Fenton，1984）和負責凝血酶與纖維蛋白原專一性作用的陰離子結合位點（識別位點）R（Fenton et al.1989；Henriksen and Mann，1988）。水蛭素的N端能封阻凝血酶的活性位點，其疏水結構域與凝血酶的非極性結合位點（AB）互補；該非極性結合位點靠近凝血酶的催化中心。水蛭素C末端有6個酸性氨酸，能與帶正電的凝血酶識別位點形成許多離子鍵。N端、C端兩個功能域以協同的方式結合到凝血酶上，在凝血酶的活性部位形成一個帽子，阻止底物的結合。

為了更好地了解水蛭素結構對性能的影響，人們對於水蛭素的N端、C端和各位點做了大量研究，得出許多結論，為水蛭肽的設計打了堅實的理論基礎。各種研究表明水蛭素C末端的10個氨基酸是必需的最小結構，C末端的最佳大小至少是12個氨基酸（Hir54-65），在這一序列中每個氨基酸都非常重要。幾個疏水殘基和酸性殘基對於維持水蛭素C末端的功能非常重要。

1.水蛭素，主要是從吸血水蛭的唾液中分離提純出來，具有抗凝，抗血栓功效的多肽物質，臨床常用於多重血栓性疾病的治療，可以消除血管阻塞，使血細胞解聚，血栓消散，促進微血管復通，消除脂肪肝，直接溶化血栓，消除動脈粥樣硬化，防止中風和再次中風，激活人體自身的溶栓功能，避免再次產生溶栓等。

2.制水蛭是將水蛭洗乾淨，晾乾，用滑石粉熱炒，炒至水蛭鼓起，篩去滑石粉，粉碎，就得到水蛭藥粉了，具有通經，破瘀消腫的功效，主要用於月經閉止，症瘕腹痛，蓄血，跌打損傷，淤血作痛，癰腫丹毒等症的治療。

從上述水蛭素和水蛭的功效來看，顯然水蛭素對中風的效果比制水蛭好。