氨基酸發酵
氨基酸發酵
1908年經池田菊苗鑒定，日本傳統上用作調味品的一種海藻昆布的增味特性是由L一谷氨酸產生的。此發現導致第二年由味之素公司工業生產L一谷氨酸；在那時，水解麥鼓和大豆蛋白質得到L一谷氨酸。1957年木下祝郎等分得一株L一谷氨酸產生菌，並用發酵法工業生產L一谷氨酸，並相繼研究出發酵技術，從此開創了氨基酸發酵的歷史。
①食品業：增鮮劑，甜味劑 ②醫藥：營養型葯 治療型葯
③飼料業 ④化學工業：洗滌劑
⑤農業 ⑥化妝品：護素 霜
氨基酸發酵，就是以糖類和銨鹽為主要原料的培養基中培養微生物，積累特定的氨基酸。
①發酵法：直接發酵法和添加前體發酵法
③酶法（Enzyme）：利用微生物細胞(微生物)產生的酶來製造氨基酸。
日本Ajinomoto 、韓國cJ、日本Kyowa Hakko以及韓國BASF和美國ADM及德國Degussa
氨基酸發酵工業：是利用發酵微生物的生長和代謝活動生產各種氨基酸的現代工業。
研究目的：探討氨基酸發酵工廠的生產技術。
研究對象：生產過程、微生物生化問題、分析設備問題。
學習任務：生產中的具體問題、育種問題、代謝控制問題、分離精製的原理方法、具有育種、探索新工藝、科研能力。
①澱粉質量好，不能有霉變
②澱粉濃度儘可能低
③糖液中不含糊精
④糖液要清，色澤要淺
⑤糖液要新
⑥蛋白質含量－高時易產生泡沫
⑦水解糖的質量標準：色澤要淺黃色，透明，無糊精，還原糖98%左右，DE值90%以上，透光率60%以上，pH4.6-4.8。
①酸解法：特點：工藝簡單、水解時間短，生產效率高，設備周轉快
②酸酶法 特點：採用酸酶法水解澱粉製糖，具有酸液化速度快的優點。糖化是由酶來完成的，因而可採用較高的澱粉乳濃度，提高生產效率。用此法，酸用量少，產品顏色淺，糖液質量高。
③雙酶法 優點：
（1）水解糖液純度高，DE值可達98%以上，使糖液得到充分利用。
（2）反應條件較溫和。
（3）可以在較高的澱粉濃度下水解
（4）可用粗原料。
（5）雙酶法製得的糖液顏色淺，較純凈，無苦味，質量高。
（6）減少糧食消耗。
缺點：
（1）酶反應時間長，生產周期長，夏天糖液容易變質
（2）酶本身是蛋白質，引起糖液過濾困難。
（3）要求設備較多，水解條件要求嚴格。
7.澱粉酸水解的化學反應分複合反應、分解反應、酸解。
8.谷氨酸的生物合成包括酵解途徑(EMP)、磷酸戊糖途徑(HMP途徑)、三羧酸循環(TCA循環)、乙醛酸循環、伍德－沃克曼反應(CO2固定反應等)。
9.生成谷氨酸的主要酶促反應
（1）谷氨酸脫氫酶(GHD)所催化的還原氨基化反應
α-酮戊二酸+NH4+ +NADPH2——→谷氨酸+H2O+NADP
GHD
(2)轉氨酶(AT)催化的轉氨反應
(3)谷氨酸合成酶(Gs)催化的反應
一、優先合成與反饋調節
(1) 、優先合成
(2) 、反饋調節
①谷氨酸脫氫酶(GDH)的調節 谷氨酸對谷氨酸脫氫酶存在著反饋抑制和反饋阻遏。
②檸檬酸合成酶的調節 檸檬酸合成酶是三羧酸循環的關鍵酶，除受能荷調節外，還受谷氨酸的反饋阻遏和烏頭酸的反饋抑制。
③異檸檬酸脫氫酶的調節 異檸檬酸脫氫酶催化的異檸檬酸脫氫脫羧生成aα-酮戊二酸的反應和谷氨酸脫氫酶催化的aα-酮戊二酸還原氨基化生成谷氨酸的反應是一對氧化還原共軛反應，細胞內aα -酮戊二酸的量與異檸檬酸的量需維持平衡。當aα -酮戊二酸過量時對異檸檬酸脫氫酶發生反饋抑制作用，停止合成。
④a -酮戊二酸脫氫酶在谷氨酸產生菌中先天性地喪失或微弱。
⑤磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的調節。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反饋抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反饋阻遏。
二、糖代謝的調節
1、能荷控制(細胞內的能量水平)
2．生物素對糖代謝的調節
(1)生物素對糖代謝速度的影響
生物素對糖代謝的影響主要是影響糖解速度
(2)生物素對CO 2固定反應的影響
①由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的反應
②由丙酮酸羧化酶催化的反應
(3)生物素對乙醛酸循環的影響
乙醛酸循環中關鍵酶是異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶。
①異檸檬酸裂解酶催化的反應
②蘋果酸合成酶催化的反應
三、氮代謝的調節
控制谷氨酸發酵的另外一個關鍵因素就是降低蛋白質的合成能力，使合成的谷氨酸不去轉化成其它氨基酸和參與蛋白質的合成。
四、其它調節
11.以葡萄糖為原料發酵生產谷氨酸時，幾乎看不到異檸檬酸裂解酶的活性的原因
原因：①丙酮酸氧化能力下降，醋酸的生成速度慢，所以為醋酸所誘導形成的異檸檬酸 裂解酶就很少。②由於該酶受琥珀酸阻遏，在生物素亞適量條件下，因琥珀酸氧化能力降低而積累的琥珀酸就會反饋抑制該酶的活性，並阻遏該酶的生成，乙醛酸循環基本上是封閉的。這樣就使代謝流向異檸檬酸g a－酮戊二酸g谷氨酸的方向高效率地移動。
12.澱粉酸水解原理
原理：酸作用於澱粉能生成糖，最後生成葡萄糖。
酸 分解 氨基酸
酸法：澱粉－－→葡萄糖——→5-羥甲基糠醛——→色素
↓複合反應
二糖
13.控制磷脂的合成，導致形成磷脂合成不足的不完全的細胞膜（在谷氨酸發酵中如何控制細胞膜滲透性）
一.a、生物素缺陷型（使用生物素缺陷型菌種進行生產的時候，必須控制生物素的用量）
1．作用機制
生物素作為催化脂肪酸生物合成最初反應的關鍵酶乙醯輔酶A羧化酶的輔酶，參與了脂肪酸的合成，進而影響磷脂的合成。
當磷脂合成減少到正常量的1/2左右時，細胞變形，谷氨酸向膜外漏出，積累於發酵液中。
2．控制的關鍵
必須亞適量控制生物素
如果生物素過剩，就會出現只是長菌而不產酸的現象或者長菌好而產酸低。
b．添加表面活性劑（吐溫）或者飽和脂肪酸
使用生物素過量的糖蜜原料發酵生產谷氨酸時，通過添加表面活性劑或者高級飽和脂肪酸（C16-18）及其親水聚醇酯類，同樣能清除滲透屏障物，積累谷氨酸。
1．作用機制
在不飽和脂肪酸的合成過程中，作為抗代謝物具有抑制作用，對生物素有拮抗作用。通過拮抗生物素的生物合成，導致磷脂合成不足，結果形成磷脂不足的細胞膜。提高了細胞膜對脂肪酸的滲透性。
2．影響產酸的關鍵 必須控制好添加表面活性劑、不飽和脂肪酸的時間與濃度，必須在藥劑添加之後
C．油酸缺陷型 使用油酸缺陷型菌株進行谷氨酸發酵時，必須限制發酵培養基中油酸的濃度
油酸過量時，只長菌不產酸，或者長菌好而產酸低
d．甘油缺陷型 使用甘油缺陷型菌株進行谷氨酸發酵時，必須限制發酵培養基終甘油的濃度
二。阻礙谷氨酸菌細胞壁的合成，形成不完全的細胞壁，進而導致形成不完全的細胞膜
第一.①、作用機制
添加青霉素是抑制谷氨酸生產菌細胞壁的後期合成，主要是抑製糖肽轉移酶，影響細胞壁糖肽的合成。
②、影響產酸的關鍵
在生長的對數期階段添加青霉素是影響產酸的關鍵。
第二。物理控制方法 利用溫度敏感型細胞進行谷氨酸發酵時，由於僅僅控制溫度就能實現谷氨 酸的生產，所以我們把這種新工藝稱為物理控制方法。
F（1）突變位置
（2）影響產酸的關鍵 在生長的什麼階段轉化溫度是影響產酸的關鍵
第三、強制控制工藝的要點和實例
14.現有谷氨酸生產菌主要是棒桿菌、短桿菌、小桿菌及節桿菌。
15.谷氨酸發酵的代謝控制育種日常菌種工作
①、定期分純(一般1～2個月分純一次)
②、小劑量誘變刺激（紫外線、通電、激光）
③、高產菌製作安瓿管
16.選育耐高滲透壓菌株
①．耐高糖：選在20~30%葡萄糖的平板上生長好的突變株
②.耐高谷氨酸：選育在15~20%味精的平板上生長好的突變株
③.耐高糖、高谷氨酸：選育在20%葡萄糖加15%味精的平板上生良好的突變株。
17.選育不分解利用谷氨酸的突變株
以谷氨酸為唯一碳源菌體不長或生長微弱的突變株
（1）平板法：選育不長或生長微弱的菌。
（2）搖瓶法：選育OD值凈增極少的菌。
19.發酵培養基，溫度，PH值，供氧，二氧化碳，泡沫等對谷氨酸發酵的影響
一。培養基
谷氨酸發酵培養基包括碳源、氮源、無機鹽、生長因子及水等。
培養基中糖濃度對發酵的影響
培養基中糖濃度對谷氨酸發酵有很大影響。在一定的範圍內，谷氨酸產量隨糖濃度增加而增加，但糖濃度過高對菌體生長和發酵均不利。
氮源
常用氮源 無機氮 有機氮
（1）尿素 蛋白質
（2）液氨 腖
（3）碳酸氫銨 氨基酸
尿素的用途：組成菌體含氮部分
組成谷氨酸的氨基
調節pH值，形成谷氨醯胺
無機鹽：
無機鹽是微生物生命活動所不可缺少的物質。其主要功能是構成菌體成分；作為酶的組成部分；酶的激活劑或抑製劑；調節培養基的滲透壓；調節pH值和氧化還原電位等。
①磷酸鹽
磷是某些蛋白質和核酸的組成成分。腺二磷(ADP)、腺三磷(ATP)是重要的能量傳遞者。參與一系列的代謝反應。磷酸鹽在培養基中還具有緩衝作用。
磷量對谷氨酸發酵影響很大。磷濃度過高時，菌體的代謝轉向合成纈氨酸，但磷含量過低，菌體生長不好。
②硫酸鎂
鎂是某些細菌的葉綠素的組成成分，此外並不參與任何細胞結構物質的組成，但它的離子狀態是許多重要的酶(如己糖磷酸化酶、異檸檬酸脫氫酶、羧化酶等)的激活劑。
硫存在於細胞的蛋白質中，是含硫氨酸酸的組成成分。硫是構成一些酶的活性基團。
③鉀鹽
鉀不參與細胞結構物質的組成。它是許多酶的激活劑。谷氨酸發酵產物生成所需要的鉀鹽比菌體生長需要量高。
菌體生長需鉀量約為0.1g/L (以K 2SO4計)，谷氨酸積累需鉀量為0. 2～ 1.0g/L 。鉀對谷氨酸發酵有影響，鉀鹽不足時長菌體，鉀鹽充足時產谷氨酸。
④微量元素
一般作為碳氮源的農副產物天然原料中，本身就含有某些微量元素，不必另加。
某些金屬離子，特別是汞和銅離子，具有明顯的毒性，抑制菌體生長和影響谷氨酸的合成，因此，必須避免有害離子加入到培養基中。
生長因子
①生物素
若生物素不足，菌體生長不好，谷氨酸產量也低。表現為長菌慢，耗糖慢，發酵周期長。
②維生素B1（硫胺素）
維生素B1對某些谷氨酸菌種的發酵有促進作用
二。溫度對谷氨酸發酵的影響
正面影響
從酶反應動力學來看，溫度升高，反應速度加快，生長速度快，產物生成提前。
負面影響
①酶是蛋白質，受熱容易失活，溫度愈高失活愈快。 ②溫度高，菌體易衰老。 ③溫度還通過影響發酵液的性質來間接影響發酵。
谷氨酸發酵
最適溫度為35～37℃，溫度高，菌體易衰老，表現為OD值增長慢，耗糖慢，pH值升高，發酵周期長，谷氨酸生成少。
三.pH值對谷氨酸發酵的影響
①影響酶的活性
②影響微生物細胞膜所帶電荷，從而改變細胞膜的滲透性，影響微生物對營養物質的吸收和代謝產物的排泄。
③影響培養基某些營養物質和中間代謝產物的離解，進而影響微生物對這些物質的吸收。
④ pH值的改變，引起菌體代路途徑的改變，使代謝產物發生變化。
四。供氧對谷氨酸發酵的影響
糖濃度高、生物素含量高，需氧量大。
糖濃度低、生物素含量低、需氧量小。
CO2對谷氨酸發酵的影響
（1）促進固定反應
由磷酸烯醇式丙酮酸羧化生成草醯乙酸，提供合成谷氨酸所必須的四碳二羧酸，無CO2 存在時，這一步無法進行。
（2）CO2過高，影響菌體正常呼吸
（3）與供氧相比， CO2的作用很小
五。泡沫 泡沫是空氣溶解在發酵液中和產生二氧化碳的結果
泡沫的消除方法 ①物理方法：改變溫度
②機械法：優點：可節省原料；防止污染。
缺點：不能從根本上消除引起泡沫穩定的因素。
③化學消泡劑 優點：消泡效果好，作用快。
缺點：需消泡劑，可增加染菌機會；氧的傳遞及菌體代謝；
20.發酵熱：引起發酵過程溫度變化的原因是發酵過程所產生的熱量
發酵熱包括生物熱、攪拌熱、蒸發熱和輻射熱等。
21.提煉：將谷氨酸生產菌在發酵液中積累的谷氨酸提取出來，再進一步中和、除鐵、加工精製成谷氨酸單鈉鹽（俗稱味精）這個過程叫提煉。
22.谷氨酸的提取原理：谷氨酸在生產上可以分為谷氨酸提取與精製兩個階段。谷氨酸的分離提純通常應用它的兩性電解質的性質，谷氨酸的溶解度、分子大小、吸附劑的作用以及谷氨酸的成鹽作用等，可以把發酵液中的谷氨酸提取出來。
23.谷氨酸的提取工藝
（1）等電點法 將發酵液加鹽酸調節pH至谷氨酸的等電點，使谷氨酸沉澱析出，其收率可以達到60%～70%。如果採用冷凍低溫等電點法，液溫冷凍至5℃以下，收率可以達到78%左右。
（3）金屬鹽法 金屬鹽法包括鋅鹽法和鈣鹽法，既利用谷氨酸與鋅離子、鈣離子、鈷離子等金屬離子作用，生成難溶於水的谷氨酸金屬鹽，沉澱析出，在酸性環境中谷氨酸金屬鹽被分解，在pH2.4時，谷氨酸溶解度最小，重新以谷氨酸形式結晶析出。
（4）鹽酸水解－等電點法 發酵液經濃縮后加鹽酸水解，可回收部分谷氨酸，從而使谷氨酸的提取收率和谷氨酸質量得到提高
（5）離子交換膜電滲析法提取谷氨酸 根據滲透膜對各種離子的選擇滲透性不同而將谷氨酸分離，如電滲析和反滲透法。
24.發酵液的主要成分
(1) 谷氨酸為L－型，以谷氨酸鐵鹽形式存在
(3)大量菌體、蛋白質等固形物質懸浮在發酵液中，濕菌體約佔發酵液的5—8%。
(4) 發酵副產物，如：有機酸類、氨基酸類。
(5) NH4+0.6~0.8%、殘糖1%以下。
(6)核苷酸類物質及其降解產物
25.谷氨酸的結晶： α －型結晶。β－型結晶
26.影響谷氨酸結晶的主要因素
(1)谷氨酸含量對結晶晶型的影響
(2)溫度與降溫速度對谷氨酸發酵：結晶析出溫度小於30 ℃控制液溫緩慢下降，不可回升
(3)加酸速度與終pH的影響：當pH>5時，可以快些；pH<5時，加酸速度要慢，出現晶核時，要立即停止加酸
(4)投晶種與育晶 投晶種要控制投入時間和pH
(5)攪拌的影響：有利於晶體長大，攪拌太快引起晶體的磨損，結晶細小。太慢晶體下沉，形成微晶細核。
(6)菌體的影響 菌體影響谷氨酸結晶，不易與谷氨酸分離。
(7)殘糖的影響
(8)L-谷氨醯胺對晶型的影響
(9)雜菌和噬菌體的影響
(10)水解糖液質量對晶型的影響
(11)發酵液pH值對晶型的影響
(12)不同菌種對提取的影響
27.等電點工藝的類型
帶菌體直接常溫等電點；
帶菌體冷凍低溫一次等電點：
除菌體常溫等電點；
濃縮水解等電點
低溫濃縮等電點等。
28.732#陽離子交換樹脂，發酵液中不同陽離子在交換樹脂中的分層比較明顯。按其對強酸性陽離子交換樹脂的親和力大小，程序依次為：Ca++>Mg+> K+>NH4+> Na+鹼性氨基酸> 中性氨基酸>谷氨酸>天門冬氨酸
29.產生DL－谷氨酸鈉的原因
①中和操作過程中，先加鹼，后加谷氨酸，在高溫度下，長時間處於強鹼性，使L－谷氨酸鈉轉為DL－谷氨酸鈉消旋化反應，使谷氨酸鈉含量下降。
② pH值對味精含量的影響 谷氨酸鈉溶液隨pH升高，在高溫下，長時間加熱，谷氨酸鈉破壞也隨著增加。且隨pH升高，鹼性增加，消旋化程度增加。
③不同加熱時間對味精含量的變化曲線 隨著加熱時間的延長，DL－谷氨酸鈉的含量增加。
30.谷酸中和的工藝條件
（1）投料比
濕谷氨酸∶水（或渣水）≈1∶2
濕谷氨酸∶純鹼≈1∶0.3～0.34
濕谷氨酸∶活性炭≈1∶0.01（舊炭或新炭）
（2）中和溫度：夏天60℃，冬天65℃。
（3）中和pH值要求：中性pH6.96
（4）中和液濃度：21～23°Bé。
31.中和液中鐵、鋅離子的來源
鐵離子的來源①生產原材料不純 設備的腐蝕
鋅離子的來源：提取工藝採用鋅鹽法
32.除鐵的方法
（1）硫化鈉除鐵（2）樹脂除鐵
33. 谷氨酸中和液的脫色
色素帶入味精成品中，會影響味精的色澤和純度
一、色素的來源
（1）生產過程的化學反應產生有色物質
澱粉水解
葡萄糖與氨基酸結合（熱）
（2）生產過程中操作不當
硫化鹼用量不當（中和）
脫色的方法：1、活性炭脫色 2、離子交換樹脂的脫色
34.工業生產中都是採用蒸發的方法進行中和液的濃縮
蒸發方法：蒸發有常壓蒸發和減壓蒸發兩種
35.蒸發過程中產生焦谷氨酸鈉
產生原因：蒸發過程中谷氨酸－鈉溶液加熱脫水環化
36.結晶包括3個過程：(1)形成飽和溶液；(2)晶核形成；(3)晶體生長。
37.工業生產上結晶有三種不同起晶方法
（1）自然起晶法（2）刺激起晶法（3）晶種起晶法
38.味精發紅的原因
1）母液除鐵不凈，含有鐵離子；
（2）母液接觸鐵器，或味精接觸鐵器；
（3）GH－15顆粒炭鹽酸再生不完全，解析鐵離子不徹底，帶入母液中。
39.味精發灰主要是壓濾過程活性炭粉末帶入母液中或GH－15顆粒炭清洗不凈，留有活性炭末子，特別遇到炭柱瀝干，上柱使大量空氣進入，產生氣泡，打亂碳層，使炭末帶入脫色液中，使製成味精出現灰色。
40.味精發青主要是母液除鐵硫化鈉過量的原因。
41.味粉混濁的原因
①、硫化鈉過量產生混濁
②、消泡油過量產生混濁
③、味粉中夾帶DL－谷氨酸鈉使溶液混濁
④、原材料質量差產生混濁
42.賴氨酸學名2，6－二氨基己酸，有L型和D型兩種構型。
43.賴氨酸生產菌及擴大培養
生產菌株
細菌: 棒桿菌、短桿菌、假單胞菌、埃希氏菌、芽孢桿菌
真菌: 酵母、假絲酵母、隱球酵母
44.賴氨酸發酵工藝條件
①、溫度
前期32 ℃ ，中後期34℃
②、pH控制
賴氨酸發酵控制pH6.5~7.5，最適6.5~7.0。在整個發酵過程式控制制pH平穩為好。
③、種齡和種量
二級種子，約2%，種齡為8～12h；三級種子，約10%，種齡6～8h；總之以對數生長期的種子為好。
④、供氧對賴氨酸發酵的影響
控制供氧充足，培養基豐富，耗氧量大。
基本信息
- 中文名
- 氨基酸發酵
- 應用
- 食品工業
- 生產企業
- 日本Ajinomoto
- 生產方法
- 氨基酸發酵