諾瑟雜交

Northern印跡雜交（Northern blot）。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術由Southern於1975年創建，稱為Southern印跡技術，RNA印跡技術正好與DNA相對應，故被稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質印跡技術則被稱為Western blot。

Northern blot 是一種通過檢測RNA的表達水平來檢測基因表達的方法，通過northern blot的方法可以檢測到細胞在生長發育特定階段或者脅迫或病理環境下特定基因表達情況。

Northern blot 首先通過電泳的方法將不同的RNA分子依據其分子量大小加以區分，然後通過與特定基因互補配對的探針雜交來檢測目的片段。“Northern blot”這一術語實際指的是RNA分子從膠上轉移到膜上的過程，當然它現在通指整個實驗的過程。Northern blot 在1977年由斯坦福大學James Alwine，David Kemp和George Stark發明。Northern blotting實際上依照比它更早發明的一項雜交技術Southern blot（依據生物學家 EdwinSouthern 名字來命名）來命名，Southern blot主要用來對DNA進行分析。

首先需要從組織或細胞中提取總RNA ,或者再經過寡聚（dT）純化柱進行分離純化得到mRNA。然後RNA樣本經過電泳依據分子量的大小對被分離，隨後凝膠上的RNA分子被轉移到膜上。膜一般都帶有正電荷，核酸分子由於帶負電荷可以與膜很好的結合。轉膜的緩衝液含有甲醯胺，它可以降低RNA樣本與探針的退火溫度，因而可以減少高溫環境對RNA降解。RNA分子被轉移到膜上后須經過烘烤或者紫外交聯的方法加以固定。被標記的探針與RNA探針雜交，經過信號顯示后表明需檢測的基因的表達。Northern blot實驗中陰性對照可以採用已經過RT-PCR或基因晶元檢測過的無表達的基因。

電泳膠

Northernblot中最為常用的電泳膠是含有甲醛的瓊脂糖凝膠，甲醛可以減少RNA的二級結構，電泳完成後的膠可經過EB染色后在紫外下檢測RNA的質量。而對小分子的RNA 或者microRNA一般採用聚丙烯醯胺變性膠電泳。RNA電泳中可以依據核糖體RNA的大小大致判斷條帶的大小，28S RNA大小一般為5kb，18S RNA 大小一般為2kb。28S RNA 的亮度一般是18S 的兩倍。

Norther blot中探針的序列需要和檢測目的基因序列互補配對，探針可以是DNA、RNA或者其它的寡聚核苷酸，但最小的長度必須大於25bp，體外合成的RNA探針可以採用更高的退火溫度來減少背景中的噪音。探針一般採用P或者地高辛來進行標記。雜交過後，可採用X膠片顯色的方法來檢測信號。

探針；分析基因的表達可以有很多種不同的方法，除northern blot 外還有RT-PCR、基因晶元、RNA酶保護實驗等。基因晶元常和northern blot一起使用，但通常情況下，northernblot的靈敏度要好於基因晶元實驗，而基因晶元優勢在於它可在一次實驗中同時反映出幾千個基因表達量的變化。與定量PCR的高靈敏度相比，northern blot顯然要遜色不少，但northern blot較高的特異性可以有效的減少實驗結果的假陽性。Northern blot 實驗中一個主要的問題是存在RNA的降解，所以northern blot中所有的實驗用品都需要經過除去RNA酶的過程，如高溫烘烤、DEPC處理等。同時，norther blot中很多實驗用品如甲醛、EB、DEPC、紫外燈等等對人體都有一定的傷害。

優缺點；Northern blot 的優勢在於它可檢測目的片段的大小、是否具有可變剪切出現、可允許探針的部分不配對性，雜交過後的膜經過一定的處理除去探針后還可保存很長時間再次雜交使用。

1，Northern blot 可用來檢測不同組織、器官；生物體不同發育階段以及脅迫環境或病理條件下特定基因的表達樣式。如northern blot被大量用於檢測癌細胞中原癌基因表達量的升高及抑癌基因表達量的下降，器官移植過程中由於免疫排斥反應造成某些基因表達量的上升，Northern blot還可用來檢測目的基因是否具有可變剪切產物或者重複序列。

2，,RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法

10×MSE緩衝液：0.2mol/L嗎啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸鈉，1mmol/LEDTApH8.0。

5×載樣緩衝液：50%甘油，1mmol/LEDTA，0.4%溴酚藍。

甲醛：用水配成37%濃度（12.3mol/L），應在通風櫃中操作，pH高於4.0。

20×SSC；

去離子甲醯胺；

50mmol/LNaOH(含10 mmol/L NaCl)；

0.1mol/LTris，pH7.5。

[1]40ml水中加7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃，加7 ml 10×MSE緩衝液，11.5ml甲醛，加水定容至70ml，混勻后倒入盛膠槽。

[2]等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩衝液的電泳槽。

[3]使RNA變性（最多20μg），RNA4.5ml,10×MSE緩衝液20ml，甲醛3.5ml，去離子甲醯胺10ml。

[4]55℃加熱15min，冰浴冷卻。

[5]加2 ml 5×載樣緩衝液。

[6]上樣、同時加RNA標記物（同位素（32P）dCTP）。

[7]60伏電泳過夜。

[8]取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。

[9]室溫下將膠浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCl中45min，水解高分子RNA，以增強轉印。

[10]室溫下將膠浸到0.1mmol/L TrisHCl(pH7.5)中45min,使膠中和。

[11]20×SSC洗膠1h。

[12]20×SSC中過夜轉印到硝酸纖維素膜上。

[13]取出硝酸纖維素膜，80℃真空烘烤2h。

<3>注意事項

[1]嚴格遵守試驗規則，務必準確。

[2]由於好多藥品是有毒的，對人體有害，請注意自身安全，做好防護