單倍體胚胎幹細胞

人和幾乎全部的高等動物，以及一大部分的高等植物均是二倍體。二倍體指由受精卵發育而來，體細胞中含有兩個染色體組的的生物個體。二倍性具有能夠穩定個體的遺傳特性的作用，一定程度上能避免突變所帶來的負面影響，因此，二倍性是有利於生物個體本身的。但是，正是因為二倍性的存在使得兩個等位基因同時發生突變產生隱性性狀大大降低，不利於遺傳分析研究。

所以，單倍體生物由於其單倍性有利於隱性純合體的獲得，在遺傳學研究中的優勢不容小覷。對於普遍存在於原核和真核單細胞低等生物類群中的單倍體的遺傳學研究已經有了很大的進展。但目前，對於哺乳動物的單倍體細胞群的獲得仍然不如低等生物那樣容易；所以也吸引了一大批科學家來研究哺乳動物單倍體胚胎幹細胞的研究。

1983年Kaufman 等曾報道從建立了源自小鼠單倍體卵母細胞單倍體幹細胞系，因此這些單倍體細胞只含有母源基因。然而，所有這些由孤雌胚胎產生細胞系在培育過程中都會自發產生二倍體的核型。

在2011年，Elling 等提出假設：haESCs可能存在與在孤雌早期胚胎中，haESCs也許能從囊胚中產生。Elling等通過實驗證明了是可以通過小鼠孤雌胚胎建立haESCs，即孤雌單倍體胚胎幹細胞（parthe- nogenetic haploid embryonic stem cells, PG-haESCs）。

Elling等建立PG-haESCs方法簡述如下。能否建立胚胎幹細胞的關鍵步驟在於未受精的卵母細胞是否能夠被“激活”產生乾性，形成孤雌的胚胎，那麼就需要在體外重複這一“激活”過程。卵母細胞一旦受精，會產生一個Ca震蕩信號，激活母源mRNA轉錄等一系列的“激活”信號，使第二極體排除，受精卵開始卵裂，進而產生整個發育過程。研究發現，可以通過SrCl（濃度為25mM）或者5%乙醇重複這一過程，使孤雌卵母細胞發生激活。

Elling等通過這種方式激活了孤雌卵母細胞，排除第二極體后，得到了只含有來自母體的一套染色體。隨後就是細胞系的建立過程。Elling等將激活后的卵母細胞移植到另一個代孕母體中。根據他們的假設，在囊胚期(embryonic day = 3.5d)取出了已經發生多次分裂的單倍體細胞，並在適合誘發胚胎幹細胞的培養基中離體培養。熒光活性細胞分選（fluorescence-activated cell sorter, FACS）循環篩選表明一小部分孤雌來源的細胞含有“減量的DNA（a reduced DNA content）”。通過多次FACS純化，Elling等得到了兩種不同的囊胚期細胞（被命名為HMSc1和HMSc2）。通過流式細胞分析（flow cytometric analysis）兩個細胞系細胞的DNA含量，發現在有絲分裂G1期含有1n倍的染色體，在有絲分裂G2期含有2n倍的染色體。再通過進一步的遺傳學分析可以得出通過該種方式能夠製備孤雌單倍體胚胎幹細胞。

同年，Leeb等 也獨立地報道了建立了小鼠單倍體胚胎幹細胞的成果。Leeb等同樣採用了SrCl來激活從超速排卵（super- ovulated）的母鼠體內提取的未受精的卵母細胞。與Elling等不同的是，Leeb等沒有採用將激活的卵母細胞移植入代孕母鼠體內，而是將激活的卵母細胞置於M16介質中培養，誘導大約22%的卵母細胞轉化為囊胚期細胞。接下來，Leeb等僅提取了內細胞團（inner cell mass, ICM）進行進一步的實驗。Leeb等將內細胞團細胞置於一種含有白血病抑制因子（leukaemia inhibitory factor，LIF）的2i介質中培養。之後，ICM細胞轉化為27組胚胎幹細胞系。再通過流式細胞分析，確認單倍體細胞含量保守估計在60%以上。

2012年，中國科學院上海生物所的Yang等在 Cell雜誌上發文報道源自小鼠的孤雄單倍體細胞（androgenetic haploid embryonic stem cells, AG-haESCs）的成功建立。Yang等 採用了兩種方式來建立AG-haESCs。

第一種方式通過核移植（nuclear transfer, NT）完成。Yang等將 Oct4-EGFP轉基因小鼠（C57BL/6背景）的單倍體精子的頭部轉移進入了移除了細胞核的卵母細胞中，注意到他們並沒有採用體細胞而是卵母細胞。通過Hoechst染色可以發現精子的頭部發生了解聚化，同時由於加入的5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine, 5 hmC）信號使得DNA發生了甲基化。這反映了供體核在去核卵母細胞中發生了重構化反應。最終，約有21%的細胞形成了囊胚期細胞。去除掉透明層（zona pellucida）后，Yang等將囊胚在基於Leeb等採用的2i介質的標準ESC培養系統中培育。在產生的34個胚胎幹細胞系中，通過FACS技術循環篩選有4個細胞系（命名為AGH-OG-1到AGH-OG-4）能夠保持單倍性。

Yang等採用的第二種方式沒有採用NT技術。雄性 Actin-EGFP轉基因小鼠精子首先使卵子受精；在核融合之前，剔除卵母細胞的雌原核（pronucleus），然後就得到了只含來自精子的染色體組——即通過精子與卵子的受精作用“替代”了核移植技術。然後通過相同的2i體外培養技術獲得了一個孤雄單倍體胚胎幹細胞系（AGH-EG-1）。

為了檢測PG-haESCs在體外（ in vitro）的分化潛能，Elling等通過培養PG-haESCs證明在形態學上，PG-haESCs可以產生正常形態的胚狀體（embryonic body, EB）。同時通過PCR技術發現PG-haESCs中許多ESC標誌性蛋白，如Nanog、Rex1、Oct4、Sox2、Klf4、Sall4和Kfl2 在EBs中都得到了下調。而一些指導胚層分化的蛋白如指導中胚層和滋養外胚層分化的Hand1、指導早期內胚層分化的Gata4/6、指導神經外胚層分化的Nestin等都得到了上調。所有的結果都表明PG-haESCs具有分化為三胚層結構的能力。

對於在體內（ in vivo）的分化潛能，Elling等通過將HMSc2細胞系的細胞移植入3.5胚齡的二倍體囊胚以期產生嵌合胚（chimaeric embryo）。通過PCR等技術探明HMSc2來源的細胞最終能分化為多種組織；並且很大一部分細胞能夠保持單倍性，即，有一部分細胞的染色體組數加倍為二倍。

Leeb等也通過類似的方式證明了相同的結論：PG-haESCs具有多向分化能力（pluripotential）。

對於孤雌單倍體幹細胞的生殖分化能力暫不明晰。

Yang等也通過相同的單倍體細胞系移植方式證明其多向分化能力。Li等 將AG-haESCs移植進入二倍體囊胚。由於培育的單倍體細胞是帶有突變基因標記的，這裡通過監測eGFP細胞即可檢測由AG-haESCs分化而來的細胞。監測結果顯示在胚齡為6.5天由各個胚層發育而來的嵌合體小鼠的臟器都有eGFP陽性信號；但是在所有的eGFP細胞中，沒有發現單倍體細胞，可能的原因是與Elling等和Leeb等實驗結果類似，發生了自發的二倍化（diploidization）。但是，在胚齡為12.5天的嵌合胚的生殖嵴中能夠檢測到有標記的細胞，說明PG-haESCs具有生殖分化能力。

綜上，AG-haESCs是具有多向分化能力的，但是較之PG-haESCs，AG-haESCs更容易在分裂分化過程中，發生自發的二倍化。

對於PG-haESCs，通過流式細胞分析（flow cytometric analysis）兩個細胞系細胞的DNA含量，發現在有絲分裂G1期含有1n倍的染色體，在有絲分裂G2期含有2n倍的染色體。

對於AG-haESCs，同樣通過流式細胞分析表明發現在有絲分裂G1期含有1n倍的染色體，在有絲分裂G2期含有2n倍的染色體。值得注意的是，所有的AG-haESCs細胞系中，性染色體均只含一條X染色體，沒有發現含有Y染色體的細胞存在。可能的原因是Y染色體缺乏一定必要的指導發育的基因序列，僅攜帶Y染色體的AG-haESCs難以發育到囊胚階段。

在Gu等對於Tet3 DNA加雙氧酶在卵母細胞表觀遺傳重編程的作用的研究中，發現了一些單倍體細胞的表觀遺傳學特性。即在5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethyl- cytosine, 5 hmC）信號能使DNA特定區段發生甲基化。這在“激活”進入去核卵子的精子中起到了非常關鍵的作用，使得染色體發生解聚化。

此外，單倍體胚胎的印記模式也是值得關注的。Shuai等通過亞硫酸氫鹽測序發現，AG-haESCs都含有父源印記，但這種印記不穩定。在體外（ in vivo）培養過程中逐漸朝向正常受精來源的ESCs轉化，同時，母源印記開始表達。另外，在傳代過程中，一些AG-haESCs中的印記基因，如H19，會丟失部分父源印記。這種丟失會造成H19的上調，形成的轉基因小鼠的生產率低且發育遲緩。因此haESCs的印記基因對於個體存活有重要影響。

haESCs最大潛在應用價值是分子水平上的。正向遺傳學（forward genetics）著眼於通過個體的表現型研究基因組成，是一種“由表及裡”的邏輯順序；反向遺傳學（reverse genetics）著眼於通過敲除基因來研究表現型的變化，是一種“由內到外”的邏輯順序。haESCs對於大規模構建隱性突變群體有非常大的優勢，因此可以用來進行正反向遺傳學研究。Elling等、Leeb等、Yang等和Li等設計了多種使haESCs基因功能缺失的方案，建立了巨大的突變信息庫。例如Yang等採用最常見的基因打靶的方式敲除與Wnt信號通路相關基因，以證明haECs在反向遺傳學中的作用。

在正向遺傳學上，利用發現的表現型選擇相應的個體並進行克隆，然後可以發現相應的目的基因；在反向遺傳學上，可以通過基因敲除或者化學誘變等方式進行基因層面的改造，通過表現型的改變研究基因的功能和作用。

haESCs還可以在細胞水平上有非常重要的作用。這一應用類似於人工授精，可以將基因修飾過的haESC直接注射進入卵母細胞或者囊胚，直接產生含有相關基因的個體或嵌合個體，可以極大地提高修飾效率。意即，通過haESCs還可以實現非常高效地獲得轉基因生物。Li等將攜帶基因修飾的haESC與未激活的卵母細胞融合，獲得了具有繁殖能力的轉基因小鼠。遺憾的是，F1代小鼠出生后不久即死亡，一方面說明了父源印記對於個體存活的意義，另一方面也在一定程度上說明利用該項技術獲得轉基因個體的可能性。

目前，在haESCs的研究過程中，已經完成了haESCs lines的建立。但是在應用過程中仍然有非常多的問題存在。

首先是haESCs自發的二倍化的過程。不論是PG-haESCs還是AG-haESCs，所有的實驗都報道傳代一定數目后，大多數單倍體細胞會轉變為二倍體細胞。其中的機制尚未明了；一旦能夠解開其中的機理，對於單倍性的穩定維持是非常有意義的。

其次是父源印記對於子代存活的影響。傳代過程中一些父源印記會丟失，影響子代的生育能力和存活能力。然而父源印記維持機理至今不明確，一旦能明確父源印記的維持方式，可以非常顯著地提高轉基因個體存活率，提高轉基因成功率。

總之，在haESCs方面的研究已經取得了一定的進展，但還有很多的工作要做來揭開未解的謎團；這些工作的進行將極大地推動單倍體細胞在遺傳學研究中的應用。