cDNA-AFLP

1、 cDNA-AFLP技術的基本原理和實驗流程。

2、 cDNA-AFLP的技術特點。

2.1 、選擇合適的內切酶組合。

標準的cDNA-AFLP體系中，採用識別序列分別為6-bp和4-bp的雙酶切組合。在基因組AFLP分析中，限制性內切酶的選擇取決於基因組的複雜度和DNA的甲基化水平。分析cDNA時，內切酶的選擇主要取決於切割的頻率。理想的酶切組合是識別位點為6-bp的酶在每個cDNA樣品中有一個酶切位點，而在其一邊或兩邊有一個4-bp的酶切位點，酶切片段的大小在100bp~1000bp之間。因此，內切酶的選擇應最大限度覆蓋mRNA池，且所選的酶切組合可同時進行酶切和接頭的連接，減少酶切片段之間的互相連接造成的假象。因此，在選擇內切酶時，充分利用已發表的cDNA序列進行分析，篩選最佳的內切酶是一條行之有效的途徑。還可根據cDNA3′端和5′端非翻譯區富含A、T的特性，選擇識別序列的鹼基組成集中在有義的cDNA區段的內切酶，實現有目的的選擇擴增。據推測，植物基因組中大約可編碼16000至33000個基因。若選擇合適的酶切組合進行分析，幾乎所有的表達基因包括信息量極低的基因均可用cDNA-AFLP檢測。Bachem 等人 利用AseI和TaqI酶切馬鈴薯塊莖形成過程的cDNA，約45%的片段含AseI位點，87%的片段含TaqI位點，結合256個引物組合至少可分析一半的表達基因。Hartings等人通過篩選，用BstYI和MseI分析玉米不同mRNA之間的大量差異表達轉錄子。BstYI引物的選擇性鹼基改用簡併引物，僅用64對引物組合，即可對75%的mRNA進行分析，128對引物組合即覆蓋了95%以上的mRNA，實現了用最少的引物組合最大限度分析差異表達的mRNA。6-bp識別序列的內切酶只能分析少數物種的cDNA。Habu等人對標準cDNA-AFLP體系進行了修改，僅用一個識別4-bp的內切酶，大大提高了可檢測的cDNA信息量。

2.2、重複性好，假陽性低，可檢測低丰度表達的mRNA。

以PCR擴增為基礎的DD-PCR和cDNA-AFLP是目前較為常用的分析差異表達基因的方法。DD-PCR使用隨機引物，退火溫度低，引物可在多個位點結合，擴增產物不僅依賴於cDNA的初始濃度，還與引物和模板的結合質量有關。因此，DD-PCR假陽性高，重複性差，難以對基因表達進行全面的分析[5,11]。cDNA-AFLP則利用特異引物擴增，提高了PCR反應的嚴謹性，克服了DD-PCR的不足。為了驗證cDNA-AFLP的可靠性，Bachem等 選取了一個序列已知的對照基因—Patatin B2進行了分析。在引物選擇性鹼基為AseI-AA和TaqI-AC時，預測會得到一個片段大小為570bp的TDF（transcripts-derived fragment）。結果表明，獲得的TDF大小與預期的一致。將獲得的TDF克隆、測序后，99%的鹼基組成與已知序列相同。同時以另一已知基因—AGPase進行了比較分析，獲得了一致的結果。Habu等研究牽牛花的紅、白花色差異表達基因時，比較了DD-PCR和cDNA-AFLP的擴增結果。在DD-PCR分析中，128對引物組合擴增得到6500條帶，其中有差異的為171條。在隨機選取的36條差異帶中，僅15條可重複再現，其中只有兩條帶真實反應了mRNA之間的差異。而用cDNA-AFLP分析時，96對引物即得到了5000條帶，其中差異帶為14條。隨機選取其中5條差異帶進行驗證，重複性可達100%。此外，DD-PCR利用polyT和隨機引物，常常導致3′端非編碼區序列的大量擴增，包含的差異表達基因的信息量相對減少。研究證實[3,13]，通過cDNA-AFLP獲得的TDF則集中在基因的蛋白編碼區或其附近區域，可最大限度獲取編碼區的信息。

2.3 、準確反映基因間表達量的差別。

在RNA差異顯示中，PCR反應條件不嚴謹，錯配率較高，擴增條帶的強度與基因的表達量無直接相關性。而cDNA-AFLP技術的最大優點就是轉錄產物高度表達時，擴增條帶的強度能夠準確反映基因間表達量的差別。Bachem等人充分利用cDNA-AFLP技術的這一優點，對馬鈴薯塊莖形成過程的基因表達特性進行了研究，並獲得了多個塊莖形成過程中特異表達的TDF。1996年，Bachem等人首次用cDNA-AFLP獲得了兩個馬鈴薯塊莖形成過程中特異表達的TDF531 和TDF536。序列分析表明，二者與編碼塊莖中脂肪氧化酶的兩個LOX高度同源。TDF531在塊莖形成0~2天時低水平表達，然後平穩增至第10天達到高峰。TDF536則在第6~10天表達。同時通過不同組織分析表明，二者在匍匐莖、葉和葉柄中不表達，莖和根中低水平表達，具高度的塊莖形成特異性。Huang等在研究采后72小時內木薯塊莖采後生理變質的分子機理時，根據表達強度對獲得的TDF進行分析表明，有誘導表達、減弱表達、瞬時表達和特異表達四種不同的表達模式參與了這一過程。

2.4 、全面獲取轉錄組的表達信息。

cDNA-AFLP不需要預先知道任何序列信息，且實驗操作簡便，可在任何實驗室進行。與SGAE和微陣列相比，該技術更適合對生物體轉錄組進行全面分析。隨著擬南芥和水稻等模式植物基因組測序的逐漸完成，表達基因的研究逐漸從某一發育階段的某一基因轉向全面的基因表達分析上。Donson等以擬南芥的各種組織和不同處理的植株為實驗材料，通過對獲得的cDNA-AFLP片段進行系統測序，建立了高容量的轉錄組表達資料庫，可覆蓋三分之二的擬南芥轉錄組，大大方便了差異表達基因的篩選。而對於三分之一未測序的轉錄組，可根據cDNA-AFLP片段在凝膠上的遷移率、內切酶酶切位點和選擇性鹼基及條帶強度等信息通過資料庫進行預測，準確率可達90%。