AFLP

AFLP是基於PCR技術擴增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內切酶切割，然後將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點序列，作為引物結合位點。限制性片段用二種酶切割產生，一種是罕見切割酶，一種是常用切割酶。它結合了RFLP和PCR技術特點，具有RFLP技術的可靠性和PCR技術的高效性。由於AFLP擴增可使某一品種出現特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無此譜帶產生，因此，這種通過引物誘導及DNA擴增后得到的DNA多態性可做為一種分子標記。

AFLP可在一次單個反應中檢測到大量的片段。所以說AFLP技術是一種新的而且有很大功能的DNA指紋技術。

AFLP技術是基於PCR反應的一種選擇性擴增限制性片段的方法。由於不同物種的基因組DNA大小不同，基因組DNA經限制性內切酶酶切后，產生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的雙鏈接頭與酶切DNA片段連接作為擴增反應的模板，用含有選擇性鹼基的引物對模板DNA進行擴增，選擇性鹼基的種類、數目和順序決定了擴增片段的特殊性，只有那些限制性位點側翼的核苷酸與引物的選擇性鹼基相匹配的限制性片段才可被擴增。擴增產物經放射性同位素標記、聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，然後根據凝膠上DNA指紋的有無來檢驗多態性。Vos等(1995)曾對AFLP的反應原理進行了驗證，結果檢測到的酶切片段數與預測到的酶切片段數完全一致，充分證明了AFLP技術原理的可靠性。

進行AFLP分析時，一般應用兩種限制性內切酶在適宜的緩衝系統中對基因組DNA進行酶切，一種為低頻剪切酶，識別位點為六鹼基的rare cutter；另一種為高頻剪切酶，識別位點為四鹼基的frequent cutter。雙酶切產生的DNA片段長度一般小於500bp，在AFLP反應中可被優先擴增，擴增產物可被很好地分離，因此一般多採用稀有切點限制性內切酶與多切點限制性內切酶相搭配使用的雙酶切。常用的兩種酶是4個識別位點的Mse I和6個識別位點的EcoR I。

AFLP接頭和引物都是由人工合成的雙鏈核苷酸序列。接頭(Artificial adapter)一般長14～18個鹼基對，由一個核心序列(Core sequence)和一個酶專化序列(Enzyme-specific sequence)組成。常用的多為EcoR I和Mse I接頭，接頭和與接頭相鄰的酶切片段的鹼基序列是引物的結合位點。AFLP引物包括三部分：5′端的與人工接頭序列互補的核心序列(core sequence，CORE)，限制性內切酶特定序列(enzyme-specific sequence，ENZ)和3′端的帶有選擇性鹼基的粘性末段(selective extension，EXT)。

AFLP反應程序主要包括模板DNA製備，酶切片段擴增及凝膠電泳分析這3個基本步驟。各步驟具體的過程有：

首先要製備高分子量(HMW)基因組DNA，選擇6個鹼基識別位點的限制性內切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。

酶切后的限制性片段在T4連接酶的作用下與特定的接頭相連接，形成帶有接頭的特異性片段。

DNA片段的預擴增。

在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的選擇性擴增。

PCR產物變性后在含尿素的聚丙烯醯胺變性膠上電泳。

多態性比較分析，特異片段回收克隆分析。

Genomic AFLP

cDNA-AFLP

AFLP具有可靠性好，重複性強，可信度高等優點，廣泛應用於遺傳育種研究，在動物遺傳育種、動物基因組研究中有著廣泛的應用前景。如：

構建遺傳連鎖圖譜

利用AFLP快速鑒別與目的基因緊密連鎖的分子標記

AFLP輔助的輪迴選擇育種

利用AFLP技術研究基因表達與調控

分類和進化研究

甲基化研究

（1）分析所需 DNA 量少，僅需 0.5μg。也可以用作於線粒體DNA。從線粒體中得到RFLP 研究所需的幾十到上百μg 的 DNA 是很困難的。Roseudahl 和 Taylor(1997) 成功地從一種真菌(Mycorrhizal fungi) 的單個孢子中得到 AFLP 標記，而每個單孢子僅產生約0.1～0.5μgDNA。另外,AFLP 反應對模板濃度的變化不敏感，DNA 濃度在 1000 倍的範圍內變化時對反應的影響都不太大，所產生的指紋圖譜十分相似。

（2）可重複性好。AFLP分析基於電泳條帶的有或無，高質量的DNA和過量的酶可以克服因DNA酶切不完全而產生的失真,PCR中較高的退火溫度和較長的引物可將擴增中的錯誤減少到最低限度，因而AFLP分析具有很強的可重複性。Jones等（1997）在歐洲8個實驗室使用共同的樣本，進行嚴格的實驗，將得到的DNA圖譜進行比較，172條譜帶中僅一條出錯，誤差小於0.6%。

（3）多態性強。AFLP 分析可以通過改變限制性內切酶和選擇性鹼基的種類與數目，來調節擴增的條帶數，具有較強的多態分辨能力。設計不同的人工接頭就會相應地產生不同的 AFLP 引物，引物 3'端的選擇性鹼基數目可以是 2+2, 2+3 也可以是 3+3，這些鹼基的組成也是多種多樣的。由於 AFLP引物設計的巧妙與搭配的靈活，使得 AFLP 能產生的標記數目是無限的。迄今為止，每個 AFLP 反應能檢出多態片段之多，信息量之大，效率之高是其它任何一種分子標記所無法比擬的。

（4）解析度高。AFLP 擴增片段短，適合於變性序列凝膠上電泳分離，因此片段多態性檢出率高，而 RFLP 片段相對較大，內部多態性往往被掩蓋。

（5）不需要 Southern雜交，無放射性危害，且不需要預先知道被分析基因組DNA的序列信息，是一種半隨機的 PCR。

（6）樣品適用性廣。AFLP 技術適用於任何來源和各種複雜度的DNA ,如基因組山東農業大學博士學位論文29DNA、cDNA、質粒、某一個基因或基因片段，且不需要預知這些DNA 的序列特徵。用同樣一套限制酶、接頭和引物，可對各種生物的DNA 進行分子遺傳標記研究。

（7）穩定的遺傳性 AFLP 標記在後代中的遺傳和分離中符合Mendel式遺傳規律，種群中的 AFLP 標記位點遵循 Hardy－Weinberg 平衡總之，在技術特點上，AFLP 實際上是 RAPD 和 RFLP 相結合的一種產物。它既克服了 RFLP 技術複雜、有放射性危害和 RAPD穩定性差，標記呈現隱性遺傳的缺點；同時又兼有二者之長。近幾年來，人們不斷將這一技術完善、發展，使得 AFLP 迅速成為迄今為止最有效的分子標記。