瓊脂擴散試驗
瓊脂擴散試驗
瓊脂擴散試驗為可溶性抗原與相應抗體在含有電解質的半固體凝膠（瓊脂或瓊脂糖）中進行的一種沉澱試驗。瓊脂在實驗中只起網架作用，含水量為99%，可溶性抗原與抗體在其間可以自由擴散，若抗原與抗體相對應，比例合適，在相遇處可形成白色沉澱線，是為陽性反應。沉澱線在凝膠中可長時間保持固定位置並可經染色后乾燥保存。沉澱線（帶）對抗原與抗體具有特異的不可透性，而非特異者則否。所以一個沉澱線（帶）即代表一種抗原與抗體的沉澱物，因而本試驗可對溶液中不同抗原抗體系統進行分析研究。
異常結果
增高胎兒宮內感染，新生兒TORCH症群，慢性或亞急性感染，瘧疾，傳染性單核細胞增多症，支原體肺炎，肝病，結締組織疾病，巨球蛋白血症，無癥狀性單克隆IgM病等。降低遺傳性或獲得性抗體缺乏症，混合性免疫缺陷綜合症，選擇性IgM缺乏症，蛋白丟失性腸病，燒傷，抗Ig抗體綜合症（混合性冷球蛋白血症），免疫抑製劑治療等。
需要檢查的人群
新生兒和有相關疾病和癥狀的患者均要檢查。
結果陽性可能疾病：
不合宜人群：無特殊要求。
檢查時的禁忌：禁忌暴飲暴食，和劇烈運動，適宜在早晨空腹檢測。
檢查時要求：試驗前應做預試驗，確定抗體的稀釋度。加樣時不要將瓊脂劃破，以免影響沉澱線的形成。加樣時不同濃度抗體和抗原不要混淆，影響試驗結果。
可溶性抗原與相應抗體特異性結合，兩者比例適當並有電解質存在及一定的溫度條件下，經一定的時間，可形成肉眼可見的沉澱物，稱為沉澱反應。沉澱反應的抗原可以是多糖、蛋白質、類脂等，與相應的抗體相比，抗原分子小（<20pm）,單位體積內所含抗原量多，具有較大的反應面積。為了使抗原抗體之間比例適合，不使抗原過剩，故一般均應稀釋抗原，並以抗原最高稀釋度仍能與抗體出現沉澱反應為該抗體的沉澱反應效價（滴度）。
免疫擴散法就是使抗原與抗體在瓊脂糖凝膠中自由擴散而相遇，從而形成抗原抗體複合物，由於此複合物分子量增大併產生聚集，不再繼續擴散而形成肉眼可見的帶狀或線狀沉澱帶。抗原抗體複合物的沉澱帶是一種特異性的半滲透性屏障，它可以阻止免疫學性質與其相似的抗原抗體分子通過，而允許那些性質不相似的分子繼續擴散，這樣由不同抗原或不同抗體所形成的沉澱帶各有各的位置，從而可以分離和鑒定混合系統。
利用瓊脂糖凝膠作為擴散介質是因為一定濃度的瓊脂糖凝膠，其內部為多孔網狀。而且孔徑很大，可以允許大分子物質（分子量自十幾萬到幾百萬以上）自由通過。因為大多數抗原和抗體的分子量都在20萬以上，所以它們在瓊脂糖凝膠中幾乎可以自由擴散。而且瓊脂糖凝膠又具有良好的化學穩定性、含水量大、透明度好、來源方便、處理容易等優點，因此是免疫沉澱檢測技術中最理想的擴散介質。
瓊脂擴散試驗
（1）PH8.6，0.1M巴比妥——巴比妥鈉緩衝液
巴比妥鈉 10.3 g
巴比妥 1.84 g
硫柳汞 100 mg（防腐劑）
蒸餾水加熱溶解並定容至500ml
（2）1%預復瓊脂（或瓊脂糖）
1g瓊脂（或瓊脂糖）加蒸餾水100ml溶化即可。
（3）1%瓊脂糖凝膠
1g瓊脂糖加50ml蒸餾水置水溶中煮沸溶解或用與波爐加熱溶解（注意不要溢出且注意加入蒸發的水），然後再加入50ml上述巴比妥緩衝液混勻，置4℃保存備用。
（4）抗原及相應免疫血清。
2．設備和器材
1．預復瓊脂玻板的製備
將溶化的1%預復瓊脂用滴管加玻板上，使之能將表面復蓋即可，放於溫箱內乾燥（或自然乾燥），即可用以製備凝膠板。
2．凝膠板的製備
溶化瓊脂糖，在水平桌上將溶化的瓊脂糖倒在預復瓊脂玻板上，製成厚度約3～4mm厚的瓊脂糖凝膠板，待冷卻后根據所需形狀打孔（注意不宜在室溫下放置過久，盡量縮短操作時間，以免乾燥）。
梅花型：
瓊脂擴散試驗
將抗原加入中心孔，倍比稀釋的免疫血清加入周圍孔，留1孔加雙蒸水，以作空白對照（注意：加樣至孔滿為止，不可外溢）。待孔內液體滲入凝膠后即可放於溫盒中（如需要可重複加樣，加樣間隔時間應掌握在第一次加樣后孔內液體尚未完全擴散完的情況下即加入，以免孔周圍形成不透明的白色圈）。濕盒於25℃中，一般保溫24～48h，觀察抗原抗體產生的白色沉澱線。
免疫血清的滴度以一定抗原濃度下出現白色沉澱線的最高稀釋度來表示。
如不知抗原濃度是否與免疫血清相當時，抗原也可倍比稀釋，多做幾個梅花孔以作比較。
為了保存標本，可染色處理，步驟如下：
（2）浸洗後於玻板的凝膠上加5%甘油或用0.5%瓊脂填孔防裂，用濕的優質濾紙復在凝膠上（兩者之間不要有空氣），37℃過液使其徹底乾燥。
（3）打濕濾紙，輕輕揭下，洗凈膠面。
（4）用0.05%氨基黑（用5%醋酸配）染色10min，再用5%醋酸脫色至背景無色為止，乾燥保存。也可用0.1～0.5%考馬斯亮藍（10～20%醋酸配製）染色5～15min，再用10～20%醋酸脫色至背景無色，乾燥保存。
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