葡萄糖異構酶

葡萄糖異構酶(glucose isomerase ， GI)，又稱D-木糖異構酶(D-xy lose isomerase)。1957年最早在嗜水假單胞菌中發現其活性，後來有近百種細菌和放線菌被鑒定為產GI的菌株，其來源非常廣泛，細菌、真菌和放線菌等微生物以及植物和動物細胞中均有存在。

GI是一種胞內酶，參與對進入體內的木糖的利用，其最適的天然底物為D-木糖。後來人們發現，其在胞外可以將D-葡萄糖轉化為D-果糖。應用這種酶可以使葡萄糖漿中朽%以上的糖分轉化為果精，使甜度大大提高，從此，GI被大量應用於高果糖漿(high fructose syrup，HFS)工業生產中。

雖然不同種屬來源的GI的一級結構有一定的差異，但在空間結構上具有相似性。GIase都是非糖蛋白，一般以四聚體或二聚體形式存在。其亞基單體分子質量為19～52kD。四聚體亞基之間都以非共價鍵相結合，無二硫鍵，二聚體之間的結合力強於二聚體內的亞基間結合力，亞基單體間符合222點群對稱分佈，每個亞基單體分兩個結構域。N端的主結構域：由8股α/β螺旋摺疊結構圍成具有催化作用的“催化口袋”，內層由8條平行的β摺疊片構成，外層由8股與β摺疊片交替相鄰的α螺旋構成，α螺旋的肽鏈走向與β摺疊片成反平行，活性中心則位於β摺疊的近C埠部。C端的小結構域：由幾段α螺旋無規則捲曲成一個遠離N端的不規則環狀結構，該結構域參與亞基間的相互作用及活性中心的構建。

四聚體葡萄異構酶有4個活性中心，呈口袋狀，活性中心位於亞基催化域β桶的近C埠部。每個活性中心由2個相鄰亞基構成，包含2個二價金屬離子結合位點，以及與底物結合和催化過程相關的保守殘基。

GI它是工業上大規模從澱粉製備高果糖漿的關鍵酶，且該酶可將木聚糖異構化為木酮糖，再經微生物發酵生產乙醇。

熱穩定性

乳酸桿菌和埃希桿菌GI的熱穩定性較差，鏈黴菌和枯草芽孢桿菌GI在高溫下相當穩定。嗜熱高溫菌(Thermus thermophi lus)GI的熱穩定性最高，可能是它對Val及Pro等氨基酸的偏愛選擇，使其具有更緊密的空間結構。

底物專一性

GI除了D-葡萄糖和D-木糖外，還能以D-核糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-阿洛糖和脫氧葡萄糖以及葡萄糖C-3、C-5和C-6的修飾衍生物為催化底物。但是GI只能催化D-葡萄糖或D-木糖α-旋光異構體的轉化，而不能利用其β-旋光異構體為底物。

最適pH和最適溫度

GI的最適pH通常微偏鹼性，在7.0～9.0之間。在偏酸性的條件下，大多數種屬的GI活力很低，GI最適反應溫度一般在70～80℃。

金屬離子的影響

GI的活力及穩定性跟二價金屬離子有重大關係，Mg、Co、Mn等對該酶有激活作用，Ca、Hg、Cu等則起抑制作用。金屬離子還影響GI對不同底物的活性，如凝結芽孢桿菌GI和Mn2+結合時對木糖的活性最高，和Co結合時對葡萄糖的活性最高。

GI的催化過程主要分為4個步驟：底物結合、底物開環、氫遷移反應（異構化）和產物分子的閉環，其中氫遷移反應被認為是整個反應過程的限速步驟。

烯二醇中間體催化機制

此催化機制首先提出底物是以開環方式與酶結合的。H54作為鹼性催化劑與底物C1相互作用。底物O和O附近的水分子可能是起催化作用的酸，它使底物羰基極化從而促進烯二醇中間體的形成。

負氫離子轉移機制

晶體學和酶動力學的證據表明，GI是採用金屬離子介導的負氫離子轉移機制。關於負氫離子轉移中間體形式有兩種看法，一種是陽離子形式，在異構化過程中，Mg-2極化底物C1的羰基產生碳正離子，Mg-1和K183作為路易斯酸穩定碳正離子，同時兩個金屬離子穩定O2的負電荷。另一種是陰離子形式，提出與底物的O1、O2和D257的羧基形成氫鍵並與催化離子Mn2+配位的水分子，將質子轉移給D257的CO1而自身形成OH-離子，此OH-離子奪取底物的質子使其帶負電荷，其質子轉移是由水分子/氫氧根離子完成的。

HFCS的工業化生產中的α－澱粉酶、β－糖苷酶價格相對較便宜，而GI生產成本較高，是生產HFCS最關鍵的一步，直接影響HFCS的產量和生產成本，因此GI的生產成本對HFCS的生產具有重要意義。目前報道的商業化產生菌的酶產量在1000～35000UL，因此，篩選更優良的GI、改善GI的催化性能和工藝條件以提高轉化率和產量是生產HFCS的重要發展趨勢。如耐高溫GI、耐酸性GI、對底物親和力提高的GI、對金屬離子依賴性改變的GI、對抑製劑不敏感的GI。

為了增加GI應用於催化反應的批次，降低HFCS的生產成本，工業上一般採用固定化遊離GI或產GI的微生物細胞的方法進行HFCS的生產。國外在GI固定化方面的研究較早，技術較成熟。20世紀70年代，通過交聯、吸附和包埋等固定化技術實現了6種GI的固定化，並商業化出售。如傑能科公司生產的IGI是通過聚乙烯亞胺/戊二醛交聯GI產生菌的細胞，並添加無機載體膨潤土、硅藻土混合製得，固定化后的GI穩定性極好，在60℃的填充床反應器中的半衰期達到一年以上。

國內有關GI固定化的研究也較多，但穩定性和酶活力方面仍低於國外水平。鄧輝等 採用殼聚糖絮凝和戊二醛交聯的方法，對表達生產褐色嗜熱裂孢菌GI的重組大腸桿菌進行固定化，使固定化的酶活力達到356U·

g，半衰期達到61天，基本滿足HFCS的工業生產要求。