分子遺傳標記

應用較廣泛的分子遺傳標記有：限制性片段長度多態分析技術(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、DNA指紋分析技術(DNA Fingerprint)、隨機引物擴增多態性DNA技術(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD)、STR(Short Tandem Repeats)和擴增片段長度多態性分析技術 (Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)。

1.1 RFLP分析技術

20世紀70年代中期，遺傳學家發現了RFLP現象;1980年Botstein首先提出利用RFLP作遺傳標記構建遺傳圖譜，直到1987年Donis等人才構建出第一張人的RFLP圖譜。RFLP基本原理是基因組DNA在限制性內切酶作用下，產生大小不等的DNA片段；它所代表的是基因組DNA酶切后產生的片段在長度上的差異，這種差異是由於突變增加或減少了某些內切酶位點造成的。RFLP作為遺傳標記具有其獨特性:（1）標記的等位基因間是共顯性的，不受雜交方式制約，即與顯隱性基因無關;（2）檢測結果不受環境因素影響;（3）標記的非等位基因之間無基因互作效應，即標記之間無干擾。RFLP分析技術的主要缺陷是克隆可表現基因組DNA多態性的探針較為困難，但隨著可標記多態性探針的增多，該技術將在分子生物學研究中得到更廣泛的應用。

1.2 DNA指紋分析技術

20世紀80年代初期，人類遺傳學家相繼發現在人類基因組中存在高度變異的重複序列，並命名為小衛星DNA。它以一個基本序列(l1一60鹼基對)串連排列，因重複次數不同而表現出長度上的差異。1987年人們利用人工合成的寡核苷酸(2~4鹼基對)作探針，探測到高度變異位點，即所謂的微衛星DNA。以小衛星或微衛星DNA作探針，與多種限制性內切酶酶切片段雜交，所得個體特異性的雜交圖譜，即為DNA指紋。DNA指紋技術作為一種遺傳標記有以下特點:（1）具有高度特異性。同一物種兩個隨機個體的指紋相似係數僅為0.22，二者指紋完全相同的概率為三千億分之一;(2)遺傳方式簡明。DNA指紋遵循孟德爾遺傳定律，衛星DNA是高度變異的重複序列，所檢測的多態性信息含量較高;（3）具有高效性。同一個衛星DNA探針可同時檢測基因組中10個位點的變異，相當於數10個探針。由於衛星DNA不是單拷貝，難於跟蹤分離群體中個體基因組中同源區域的分離。

1.3 RAPD分析技術

RAPD是Williams等人(1990)發展起來的一種新型遺傳標記，儘管這一技術比較年輕，但由於其獨特的檢測DNA多態性的方式即極快速、簡捷、高效等優點，使得RAPD技術已滲透於有關基因研究的各個領域。RAPD是建立於PCR基礎之上的，利用隨機的脫氧核節酸序列作引物(一般9~10鹼基對)，對所研究的基因組DNA體外擴增，擴增產物經電泳分離染色后，來檢測其多態性，這些擴增DNA片段多態性便反映了基因組相應區域的DNA多態性。RAPD標記特點是：（1）RAPD擴增引物沒有物種的限制，一套引物可用於不同物種基因組分析;（2）RAPD擴增引物沒有數量上限制，可以囊括基因組中所有位點;（3）RAPD技術簡捷方便，可進行大量樣品的篩選。RAPD標記是顯性的，無法區分動物純、雜合體，而且在分析中易產生非特異性。

1.4 AFLP分析技術

Zabean等(1993)將PCR與RFLP結合起來，創造了AFLP分析技術。基因組DNA先用限制性內切酶雙酶切，再在兩端連上特定的人工接頭，根據接頭和酶切位點的序列設計引物。一般在引物的3'端再增加1一3個鹼基進行選擇性擴增。不同樣品由於DNA序列不同，擴增出的片段數及長度各不相同，經變性的聚丙烯醯胺電泳就能區分出不同樣品之間的差異，作為遺傳標記構建連鎖圖，或鑒定與特定性狀連鎖的標記。與RFLP比較，它無需了解DNA模板序列，產生的多態性較多；與RAPD比較，它的可重複性得到極大提高。Higuch從已滅絕的斑驢皮肌中提取DNA，經PCR擴增，進行斑驢與馬的親緣關係研究，取得成功。

2、遺傳標記在家畜育種中的應用

2.1基因定位

RAPD快速尋找同一區域連鎖DNA標記的方法，可為RFLP連鎖間隔區提供新的DNA標記，或增加同一區域分子標記的密度比。由於RAPD能在一次反應中檢測基因組的多個位點，因此它可迅速找到兩組DNA樣品間多態性差異，進而得到與此差異相連鎖的DNA標記。RAPD基因定位方法主要有兩種：（1）近等位基因系的定位。它是由提供靶基因的供體親本與輪迴親本雜交、多次回交，通過每代對靶基因選擇而獲得的、除靶基因外，其它性狀大部分與輪迴親本相同的品系；因此，它的基因組DNA除目的基因所在區域與輪迴親本不同外，余者基本相同，這樣便為RAPD對兩個基因組DNA進行多態性檢測提供了可能，找出它們基因組擴增產物的差異，用這些有差異的產物做探針，再由RFLP連鎖分析定位這些基因。（2）通過對目的基因有分離的F2進行基因定位。根據F2個體中的目的基因分離構建2個基因文庫，然後從中分別隨機抽取30個樣本，分別提取其DNA，並等量混合，又形成2個新文庫，這2個新文庫對目的基因是選擇性的，而對其它部分基因則是隨機的；利用RAPD找出與目的基因區域相連鎖的DNA多態性標記，從而定位該基因。

2.2構建基因圖譜

基因圖譜是遺傳學研究的重要內容，也是家畜遺傳育種的依據。分子遺傳標記構建遺傳圖譜的原理與形態標記相同，不同的是一個分子遺傳標記分離群體，可同時獲得幾十個乃至幾百個標記；而且可以使用不同的分離群體(暫時性或永久性分離群體)。目前，已構建出牛、馬、豬等家畜的RFLP遺傳連鎖基因圖譜。

2.3背景基因型的選擇

Hilel等(1990)認為，在回交群體中，可藉助DNA指紋的輔助選擇，從而接受或拒絕某一特定的基因組背景，這樣有助於基因的導入，但微衛星標記應用於基因導入育種方案，並不具有完美的適應性。Groen等人 (1992)假設被導入基因已被定位，即可在後代中加以鑒定，而實際上是不可能的，而且被導入的QTLs與標記基因常常發生重組現象。Smith等 (1995)在Groen等研究成果的基礎上，進一步研究在不同雜交方案中表型選擇和標記輔助選擇的效率，得出結論，利用標記選擇的效果不如表型選擇。

2.4雜交選育

根據分子標記位點的雜合性預測各組合之間的雜種優勢，可極大地減少配合力測定工作。對雜交後代的鑒定和選擇是育種工作的重要內容。在傳統育種中，有些性狀無法在早期鑒定篩選而被淘汰；如果利用這些性狀連鎖的分子標記進行輔助選擇，不僅可以早期選擇，而且能在短時間內對大量後代進行鑒定。大量研究均假設群體處於連鎖不平衡狀態，並均考慮最簡單的情況一一兩近交系間的雜交。通過雜種後代(F2)實施標記輔助選擇，而後分兩個階段進行:(1)以標識一QTL連鎖測驗的估計值游標准選用標記，對此，一個重要問題是如何在群體中選擇遺傳標記，被選標記必須能夠解釋部分遺傳為方差。從基因組所有遺傳標記中選擇某些較為理想的標記，再從新的獨立樣本群對標記效應的回歸系統進行估計，這種情況下，標記的估計值是無偏的。(2)基於標識基因型和個體表型及其親屬表型進行個體選擇。

分子標記為家畜育種開闢了一條新途徑，但能否在育種實踐中發揮應有的作用，取決於下面4個因素:(1)具有與目標基因緊密連鎖的分子標記;(2)具有多態性高的分子標記繪製的遺傳圖譜;(3)能否實現分子標記分析自動化，降低成本，簡化實驗;(4)應用標記預測育種值的方法有所改進。這4個方面已取得較大的進展，隨著生物技術的深入發展與完善，分子標記在家畜育種中將發揮越來越大的作用。